一种CHO细胞无血清无蛋白培养基及其制备方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养基的制备，具体提供了一种新的无血清、无蛋白质的、化学成分限定的细胞培养基的制备，该培养基含有多种氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物及其他补充因子；不含有任何提取物或水解物；无动物来源成分。该培养基能很好地支持CHO细胞在体外悬浮培养，满足CHO细胞培养需求；为化学成分限定培养基，成本低廉。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种适于CHO细胞大规模悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其制备方法。
技术介绍
中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary，CHO)细胞广泛应用于重组蛋白药物及抗体药物的生产，能够提供稳定而准确的糖基化修饰，使表达产物最接近于天然蛋白质分子，具有安全性高的特点。传统上CHO细胞的培养是在DMEM/F12基础培养基中添加5～10％的胎牛血清来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还提供了体外培养细胞增殖所必需的生长因子。但血清的使用存在批次间差异大、易被支原体和病毒等污染、成本高、不利于产物分离纯化等很多弊端，以及影响细胞的生长及最终产物的质量，不适于大规模工业化生产。为了克服使用血清带来的缺陷，许多所谓的“定义”培养基被开发。这些培养基往往是特别配制以支持单一细胞类型的培养，不包含任何未定义的补充剂和替代血清的纯化的生长因子、蛋白质、脂蛋白和其他物质。由于这种培养基的组分(和浓度)是精确已知的，通常被称为“限定培养基”。使用限定性培养基相比含血清或提取物的培养基，有利于研究培养基中特定的生长因子或其他成分在细胞生理学中的作用。此外，限定性培养基通常含有非常少量的蛋白质，简化了产物纯化过程，降低纯化成本。中国专利申请号200910241670.1公开了一种无血清细胞培养基，该培养基是以DMEM/F12(1∶1)为基础培养基，添加了胰岛素和转铁蛋白等物质，最高活细胞密度不足400万/ml。中国专利申请号200710307076.9公开了一种无蛋白细胞培养基，含有转铁蛋白和胰岛素替代物，但最高活细胞密度不足350万/ml。中国专利申请号201310106385.5公开了一种无血清无蛋白细胞培养基，虽然不含有胰岛素和转铁蛋白，但含有类固醇激素。目前国内开发的大多数无血清培养基都能够支持细胞生长，但大多是在已有培养基如DMEM、DMEM/F12等基础上加入各种营养物质、胰岛素、转铁蛋白、蛋白水解物等，成分复杂，使得产品的质量和安全面临考验，同时也为纯化带来了困难。而国外Life、Thermo等公司的无血清培养基虽然不含蛋白质，但其价格昂贵，成分秘而不宣，不仅增加了细胞大规模培养的成本，减小了产能提升和成本降低的空间，而且不利于根据产品需要对培养基进行优化调整，大大减少了后续的优化空间。本专利配制的无血清培养基成分明确，不含蛋白质，易于获得，成本低廉，可规避商业培养基的局限，实现营养物合理均衡供给，控制代谢副产物积累，不仅可支持细胞大规模培养，并且成分明确，可根据需求对配方组成进行优化，提高产能、节约生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的支持CHO细胞高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基，能适用于多种不同CHO细胞株生长和稳定传代，化学成分明确，营养均衡，成本低廉，支持CHO细胞更好的生长和更短的细胞倍增时间，为生物制品的规模化生产提供方便。无血清无蛋白培养基的组分一般包括氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、脂类、胰岛素和转铁蛋白替代品以及其他物质，对这些成分进行合理配比是开发和优化培养基的关键。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：采用硫酸锌、柠檬酸铁、亚硒酸钠替代胰岛素和转铁蛋白；利用统计学实验设计确定各个组分的最佳剂量。基于以上考虑，本专利技术涉及的培养基包括多种氨基酸，维生素，无机盐，葡萄糖，一种或多种脂质，胰岛素替代物和转铁蛋白替代品。氨基酸是细胞生长代谢重要的氮源与能源物质，用于蛋白、核酸以及脂类等物质的合成。细胞培养所需氨基酸种类较多达20种，且代谢相互交叉，可通过脱氨基、转氨基、联合脱氨基等作用实现转化。本专利技术的氨基酸成分优选包括选自L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸。维生素作为多种反应的催化剂参与细胞生长代谢；本专利技术的维生素成分优选包括选自生物素，氯化胆碱，D-泛酸钙，叶酸，异肌醇，烟酰胺，吡哆醇，核黄素，硫胺素和维生素B12。无机盐维持渗透压、体系pH的平衡，并作为辅因子参与多种酶反应。本专利技术的无机盐成分优选包括氯化钾，多种镁盐，锰盐，氯化钠，NaHCO3，Na2HPO4，硒盐，钒盐和锌盐。葡萄糖作为细胞代谢的主要能量来源及合成DNA等大分子的碳源。本专利技术采用硫酸锌代替胰岛素，硫酸锌能调节胰岛素和受体的水平；采用柠檬酸铁代替转铁蛋白，与细胞膜上的转铁蛋白受体结合，促进铁的跨膜传递，稳定培养基的活性；并添加化学组分明确的脂类物质、微量元素、抗氧化剂、保护细胞免受流体剪切力损伤的物质；其中所述的脂类物质包括：腐胺、精胺、乙醇胺、亚油酸、吐温-80；所述的微量元素包括：硫酸铜、硫酸锌、硫酸亚铁、硝酸铁、亚硒酸钠、硅酸钠、偏矾酸钠、氯化镍、氯化亚锡、钼酸铵、硝酸银、硫酸锰、氯化钴、氯化铝、溴化钾、碘化钾、醋酸钡、硫酸铬、氟化钠，在特定浓度范围内对细胞的生长和蛋白表达具有促进作用；所述的抗氧化剂包括：抗坏血酸、还原型谷胱甘肽；所述的保护细胞免受流体剪切力损伤的化合物为：Pluronic F-68；本专利技术涉及的培养基包含一种或多种聚阴离子或聚阳离子化合物，其中，聚阴离子化合物优选是多磺化或多硫酸化化合物，更优选肝素，硫酸葡聚糖，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，硫酸软骨素，多硫酸戊聚糖，蛋白聚糖等，并且最优选硫酸葡聚糖，其优选具有的分子量为约5,000道尔顿。基于以上各类物质对细胞生长的不同作用，本专利技术将上述物质按以下浓度进行配比：氨基酸的组分及重量份如下：维生素的组成及重量份如下：无机盐的组成及重量份如下：微量元素的组成及重量份如下：碳水化合物和其他分子的组分及重量份如下：优选的是，上述CHO培养基包括的组分及含量为：氨基酸的组成及用量如下：维生素的组分与用量如下：无机盐的组成及用量如下：微量元素的组分及用量如下：碳水化合物和其他分子的组成与含量如下：更优选的是，上述CHO培养基包括的组分及含量为：氨基酸的组成及用量如下：维生素的组分与用量如下：无机盐的组成及用量如下：微量元素的组分及用量如下：碳水化合物和其他分子的组成与含量如下：最优选的是，上述CHO培养基包括的组分及含量为：氨基酸的组成及用量如下：维生素的组分与用量如下：无机盐的组成及用量如下：微量元素的组分及用量如下：碳水化合物和其他分子的组成与含量如下：本专利技术提供的无血清无蛋白培养基pH 7.0-7.4，渗透压为290-330mOsm/kg，能够支持CHO细胞在悬浮条件下快速生长，不添加任何生长因子及蛋白水解物，化学成分明确，成本低廉，便于配制、储存。附图说明图1为倒置显微镜下观察的CHO-S细胞在实施例1制备的无血清无蛋白培养基中悬浮生长的细胞图；图2为CHO-S细胞在实施例1制备的无血清无蛋白培养基中悬浮生长的活细胞密度变化及细胞活率变化图；图3为CHO-S细胞在实施例2制备的无血清无蛋白培养基中悬浮生长的活细胞密度变化及细胞活率变化图；图4为CHO-S细胞在实施例3制备的无血清无蛋白培养基中悬浮生长的活细胞密度变化及细胞活率变化图；图5为CHO-S细胞在实施例1，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种支持CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基，其特征在于，由下列重量份的物质组成：。

【技术特征摘要】
1.一种支持CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基，其特征在于，由下列重量份的物质组成：。2.权利要求1所述的CHO细胞无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述CHO无血清培养基中还含有Pluronic F-68作为抗剪切力保护剂，所述Pluronic F-68的用量为：500-2000mg/L。3.权利要求1，...

【专利技术属性】
技术研发人员：于红阳，吴彦卓，张苗，甘一迪，贾东晨，徐明波，
申请(专利权)人：北京双鹭药业股份有限公司，北京双鹭立生医药科技有限公司，北京双鹭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11