一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法技术

一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法，本发明专利技术的基础培养基为DMEM培养基或其与F12培养基的混合；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。与现有技术相比本发明专利技术优点为：未添加动物源性或重组白蛋白，避免了可能携带的安全隐患，降低培养基成本；适用于成纤维细胞的原代和传代培养，并保持较好的细胞形态，与血清组细胞的状态和功能相似；不需采用贴壁因子包被，原代24h贴壁率＞60%，传代24h贴壁率＞80%，与血清组细胞无差异；能满足多次传代需要，且传至15代后生长状况仍保持与血清组细胞状态相似；将成纤维细胞从含血清培养中直接转入本发明专利技术培养，细胞可顺利贴壁伸展，不需逐渐适应过程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学材料
，具体涉及。
技术介绍
组织工程皮肤是目前组织工程领域的热点，近年来已经有许多产品应用于临床。组织工程皮肤研发中需要解决的一大问题是种子细胞(即表皮细胞与成纤维细胞)的大规模体外培养。传统的成纤维细胞培养是在基础培养基中添加血清，但是血清的使用会带来风险隐患:①血清中含有细胞生长抑制因子和毒性因子，有潜在细胞毒性血清组分复杂，批次间质量存在差异，增加了产品质量控制的难度和不稳定性；③目前血清中各组分及其含量对细胞生长、增殖的作用机制尚不清楚，给研发和应用带来不便；④从安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物(如引起牛海绵状脑炎的朊病毒)，给血清的使用带来了不容忽视的安全隐患；⑤由于血清培养基中的蛋白质很难通过普通分离方法彻底去除，，从而造成细胞表达产物分离纯化难度较高，严重影响产品的最终质量。这些不利因素促使了培养方法的改进，用无血清细胞培养基替代血清培养基。目前针对无血清培养基的研发主要集中在以下几种细胞:疫苗生产细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞等)、干细胞(例如间充质干细胞、胚胎干细胞、表皮干细胞等)和其他细胞(如神经细胞、内皮细胞、软骨细胞等)。无血清培养基针对性很强，没有广泛的适应性，同类型的细胞、甚至不同细胞系或细胞株都可能有各自的无血清培养基，对无血清培养基的适应往往不同。成纤维细胞因其增殖具有血清依赖性，在无血清条件下培养较为困难，所以目前针对成纤维细胞的无血清培养基很少，仅有少数外国企业的无血清培养基，主要有:ATCC 公司的 Fibroblast Growth Kit Serum-Free, Sciencell 公司的 FibroblastMedium-serum free (FM_sf)和 HyClone 公司的 FetalClone? III 等产品。国内尚无同类产品，也未见文献或专利公开有用于成纤维细胞的无血清培养基的详细资料。目前，用于其他细胞培养的无血清培养基存在的共同问题:①白蛋白作为血清的主要成分，是无血清培养基中普遍的添加成分，由于牛血清白蛋白(BSA)为动物源性蛋白，可能携带致病因子；目前的无动物源性培养基多是采用重组白蛋白(HSA)替代BSA，导致培养基成本较高。②血清中含有多种贴壁因子，依赖血清的细胞在无血清培养时则不易贴壁，所以在无血清培养贴壁细胞时，需要提前包被贴壁因子，增加了操作的复杂性，而且常用的贴壁因子(如胶原、多聚赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白等)价格昂贵，提高了培养基成本。③多数无血清培养基的使用需给细胞一个适应过程，逐步降低培养基中血清浓度，最终过渡到无血清培养；另外，在用于原代培养时，还需要额外添加2%的血清，使其不成为真正意义上的无血清培养。④无血清培养基传代次数较少，例如，ATCC公司的Fibroblast GrowthKit Serum-Free培养基在说明书中明确指出，培养10代之后细胞增殖速率减缓。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种针对成纤维细胞培养的无血清培养基，其中不添加白蛋白和贴壁因子，能够避免血清中复杂成分造成的潜在隐患，使成纤维细胞接近在含血清培养基中的生长增殖状态，从而满足规模生产和应用的需要。本专利技术所提出的无血清成纤维细胞培养基是由基础培养基与外源添加物组成，其中，基础培养基为DMEM商用培养基，或DMEM商用培养基与F12商用培养基的混合培养基；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。所述的混合培养基按体积比DMEM培养基为I~3份、F12培养基为1份；所述的外源添加物为:胰岛素或胰岛素样生长因子(IGF)为I~20 mg/L，转铁蛋白为I~20 mg/L,谷氨酰胺为I~10 mM，三碘甲状腺氨酸(T3)为0.01~5 μ Μ，氢化可的松为0.01~5mg/L，地塞米松为0.01~10 μ g/L,乙醇胺为5~30 μ M，腺嘌呤为5~30 mg/L,葡聚糖为10~30g/L,亚硒酸钠为I~15 μ g/L, 2_巯基乙醇为50~100 μ Μ,维生素E (Ve)为2~20mg/L，维生素C (Vc)为2~50mg/L，脂类浓缩剂为lmL/L，碱性成纤维生长因子(bFGF)为I~50 μ g/L，表皮生长因子(EGF)为I~10μ g/L，转化生长因子(TGF-β )为I~10μ g/L，血小板衍生生长因子(PDGF)为I~10 μ g/L。本专利技术的无血清成纤维细胞培养基，不添加动物源性白蛋白和重组白蛋白以及贴壁因子，适用于人成纤维细胞的原代和传代培养，以及由血清环境直接转入无血清环境的人成纤维细胞体外培养，所培养细胞的生长状态与含血清培养的效果一致。细胞在无血清培养时必须加有活性因子，以取代血清支持细胞生长，如各种激素、生长因子和转运蛋白等，其中起主要作用的有3~4种，普遍认为胰岛素、转铁蛋白、谷氨酰胺和亚硒酸钠是无血清培养中的必需成份。本专利技术组分中激素的作用为:激素是血清的重要成分之一，无血清培养基中激素缺乏会导致细胞无法正常增殖。本专利技术组分中包含了血清激素的几种主要组分，能最大限度的模拟血清环境，满足细胞生长，其中所含激素类化合物的作用如下。胰岛素和IGF:在无血清培养条件下，缺乏血清会使细胞的有丝分裂停止在细胞周期的Gl期，使细胞失去分裂能力，最终衰老死亡；胰岛素及IGF能够激活包括小分子G蛋白Ras在内的几种信号通路,最终激活MAPKs (Mitogen-activated protein kinases),启动DNA、蛋白质和脂肪酸的合成，使细胞由Gl期进入S期，促进细胞分裂增殖； T3是甲状腺激素的主要活性成分，在细胞分化、生长、发育及维持机体平衡稳态等方面发挥着关键作用，能够促进DNA合成和细胞对葡萄糖的吸收，近年来研究发现T3还具有调节细胞铁代谢的作用； 地塞米松和氢化可的松:属于糖皮质激素，对成纤维细胞的增殖作用是双向的，受细胞来源、接种密度、细胞代谢状态、激素作用时间长短等因素影响，对细胞起促进或抑制作用；在本专利技术的浓度范围内，这两种糖皮质激素能够促进成纤维细胞的生长。本专利技术组分中的抗氧化剂的作用为:细胞的生理代谢会产生自由基，自由基在细胞内聚集会导致细胞膜上的不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物，这种过氧化物能破坏细胞膜及其亚细胞器膜的结构，使膜肿胀、融合从而导致细胞死亡。在无血清培养时，因缺少血清中的抗氧化体系，细胞更容易积累自由基，因此需要通过添加抗氧化剂保护细胞不受自由基损伤。本专利技术与其他无血清培养基相比，抗氧化剂种类从常用的一两种增加至四种，依靠多种抗氧化剂之间的协同作用，能有效控制细胞氧化损伤，大大延长细胞培养代数。Ve和V。:维生素E能阻止类脂的氧化作用，清除脂质自由基，防止不饱和脂肪酸过氧化物的生成，对生物膜起保护作用。Ve与硒共同使用，能降低组织中过氧化物的水平。维生素C能中和体内所产生的自由基，从而减轻自由基所造成的氧化损伤，参与生物氧化和还原及细胞呼吸过程，同时有促进酪氨酸和色氨酸代谢以及胶原合成作用。V。与Ve共同使用具有协同效应，Vc能将生育酚氧自由基再生转化为VE，同时通过清除氧自由基来减少Ve的消耗； 亚硒酸钠:硒是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的必需成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无血清成纤维细胞培养基，是由基础培养基与外源添加物组成，其特征在于，基础培养基为DMEM培养基，或DMEM培养基与F12培养基的混合培养基；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。

【技术特征摘要】
1.一种无血清成纤维细胞培养基，是由基础培养基与外源添加物组成，其特征在于，基础培养基为DMEM培养基，或DMEM培养基与F12培养基的混合培养基；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的混合培养基按体积比DMEM培养基为I~3份、F12培养基为1份。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的外源添加物为:胰岛素或胰岛素样生长因子为1~20 mg/L,转铁蛋白为1~20 mg/L,谷氨酰胺为1~10 mM,三碘甲状腺氨酸为0.01~5 μ M,氢化可的松为0.01~5mg/L,地塞米松为0.01~10 μ g/L,乙醇胺为5~30 μ M,腺嘌呤为5~30 mg/L,葡聚糖为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺晓静，
申请(专利权)人：陕西博鸿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61