一种组织工程软骨支架材料，本发明专利技术的软骨支架材料由上至下依次为表层、中层和钙化层；表层由冻干软骨基质和II型胶原组成，基质纤维在水平方向平行分布；中层由冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原及TGF-β组成，基质纤维呈纵向排列；钙化层由冻干软骨基质、GAG和X型胶原及煅烧骨粉组成，其纤维呈三维交错分布。所制备的软骨支架材料具有软骨修复效果，有利于支架材料植入后与软骨下骨的融合，促进软骨下骨的再生；在复合软骨细胞后，能够用于全层软骨缺损修复，再生的软骨组织具有与天然软骨一致的空间结构和蛋白组分；适于膝关节等负重部位关节软骨的修复，再生抗压强度较大的新生软骨，提高软骨支架表面的耐磨性和抗压能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于组织工程学医用生物材料
，具体涉及一种组织工程软骨支架材料及其制备方法和制备装置。
技术介绍
关节软骨损伤是临床常见疾患。国内外调查显示，关节软骨损伤患病率约15 %，40 岁人群患病率为10% 17%，60岁以上则达50%，而在75岁以上人群中80%患有骨性关节炎伴随的软骨缺损。在美国，关节软骨损伤是导致50岁以上男性丧失工作能力的第二位原因(仅次于缺血性心脏病)，也是中年以上人群慢性致残的主要原因。据美国风湿病学会 (ACR)数据显示目前，美国约有2000万关节软骨损伤患者，估计至2020年，发病人数将上升到4000万，65岁以上老年人中，70%有关节软骨损伤症状，其中46%不同程度地丧失关节功能和劳动能力，每年门诊病人700万，住院病人300万。美国第三次国家健康与营养调查表明，8%的成人可以明确诊断为手关节软骨损伤，意味着每12个美国人中就有I人患手关节软骨损伤。保守估计，我国骨关节疾患在5000万以上。研究发现，软骨损伤发病有低龄化的趋势，临床上有症状的30 40岁的软骨损伤患者并不少见，X线普查发现15 24岁年龄组的骨关节炎发生率为10%。人关节软骨无血管、无神经，软骨细胞被周围基质限制很难迁移，因此软骨损伤后不能自愈。传统的治疗方法(如关节灌洗术和关节清理术、微骨折手术、骨膜移植、自体/异体软骨移植等)只能缓解症状，不能有效恢复受损组织功能。近年出现的软骨细胞移植技术，能够在一定程度恢复软骨组织的结构功能，但需要二次手术，并且会对供区造成损伤。组织工程软骨的开发为治疗软骨缺损提供了一种更好的选择。研究者采用多种支架材料与多种细胞构建出了性状较好的组织工程软骨；由于天然软骨不是一个无序的结构，而是由表层、移行层、辐射层和钙化层四层结构部分组成；表层结构中II型胶原含量最高，而糖胺聚糖(GAG)含量较低，其基质纤维按水平方向分布；移行层和辐射层结构中II型胶原随着深度增加其含量逐渐下降，而GAG正好相反，并且基质纤维按垂直方向排列，正是这种结构赋予了关节软骨良好的抗压特性；钙化层结构中II型胶原含量最低，GAG含量最高，并且存在有大量的X型胶原。软骨组织这种有序的结构与成份分布，最终形成了关节软骨耐磨、抗压的功能特点。基于关节软骨的生理特点，若要构建出功能与天然软骨一致的组织工程软骨，首先要制备出具有天然软骨结构特征的组织工程软骨支架材料，在其上复合种子细胞，实现与人软骨组织接近的组织工程软骨的构建。经检索，中国专利申请200610026004. 2,200910058053. 8,02113378. 6 和 201010539861. 9所构建的软骨支架为均一的组分和结构，不具有天然软骨组织结构特点。 中国专利申请200910117158. 6虽有分层结构，但其结构仅是羟基磷灰石的含量不同，软骨支架材料没有能够增加软骨抗压强度的垂直定向结构。中国专利申请201010297976. I构建的软骨修复材料呈天然软骨基质的纵向排列方式，但其并不具备软骨表层的水平排列纤维结构以及钙化层的成份特点。中国专利申请200710090962. 0公开了ー种关节软骨生物支架材料及制备方法，是将脱细胞、去抗原、去I型和X型胶原的天然软骨基质成份与II型胶原共混，以氯化钠晶体颗粒作为致孔剂，通过理化处理，制成ー种多孔的关节软骨支架材料；该方法采用天然软骨基质为原料，保证了构建材料成份与天然软骨一致，但软骨组织各层之间组分差异较大，而且钙化层去除了软骨基质中的X型胶原，不同于天然软骨基质成份。中国专利申请200510012257. X采用聚こ烯醇(PVA)与羟基磷灰石等材料构建多层软骨材料，模拟天然软骨组分在多层结构中的渐变规律，以PVA等高分子材料代替软骨组织中的胶原、蛋白聚糖等成份，但高分子聚合材料在体内的降解代谢与软骨基质完全不同，前者的降解会产生酸性产物，引起非菌性炎症反应，直接影响到移植物与周围组织的融合。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种组织工程软骨支架材料及其制备方法和装置，所制备的软骨支架材料在复合软骨细胞后，能够用于全层软骨缺损修复， 再生的软骨组织具有与天然软骨一致的结构及组分，适用于负重部位关节软骨的修复。本专利技术所提出的组织工程软骨支架材料，具有与天然软骨组织的类似结构，由上至下依次为表层、中层和钙化层；其中表层由冻干软骨基质和II型胶原组成，基质纤维在水平方向平行分布；中层由冻干软骨基质、糖胺聚糖(GAG)、X型胶原和II型胶原及转化生长因子(TGF-P)组成，其基质纤维呈纵向排列；钙化层由冻干软骨基质、GAG和X型胶原及煅烧骨粉组成，钙化层内的纤维在三维空间交错分布。由于天然软骨组织的移行层和辐射层在组分及结构功能上相似，本专利技术中把这两层结构并为ー层，构建软骨支架材料的中层， 其结构和组分与天然软骨的移行层及辐射层接近。本专利技术所提出组织工程软骨支架材料的制备方法，其特征是将天然软骨基质制备成凝胶，添加GAG、X型胶原及煅烧骨后，冻干制备钙化层；天然软骨基质与GAG、X型胶原、 II型胶原及TGF-P混合后，在钙化层表面进行低温定向結晶，经冷冻干燥后形成中层；将天然软骨基质与II型胶原复合后，采用旋转涂层方法在中层表面制备表层，晾干后得到组织工程软骨支架材料。具体步骤包括步骤一、天然软骨基质的制备在4°C条件下，将哺乳动物无软骨膜的关节软骨块放入液氮冷冻3小时后，转入预冷的粉碎机中粉碎，采用体积浓度为I %的醋酸溶液溶解， 经真空冻干得到软骨基质；步骤ニ、钙化层的制备将冻干软骨基质、GAG和X型胶原溶于体积浓度为1%的醋酸溶液中，使终浓度分别为5 12mg/ml、8 15mg/ml和5 10mg/ml,用氢氧化I丐溶液调 pH至中性，得到软骨基质溶液；将粒径0. 05 0. 2mm的煅烧骨粉按0. I 0. 5g/ml的量与软骨基质溶液混合均匀，得到凝胶溶液，将其注入培养器皿底盒，使凝胶层厚度为I 4_， 加盖后在37°C条件下待凝胶溶液凝固后，连同器皿一起置入-80°C环境中冷冻，形成钙化层；天然软骨钙化层是软骨与软骨下骨的过渡连接部位，其中的细胞主要是肥大软骨细胞，能够大量分泌GAG与X型胶原，所以钙化层中GAG和X型胶原浓度较高，形成了钙化层特殊的大分子蛋白网络结构，赋予钙化层较大的抗压强度。本专利技术人通过研究天然软骨钙化层中两种主要组分GAG和X型胶原的含量特点，在冻干软骨基质内添加GAG和X型胶原制备钙化层，证实所构建的钙化层在复合软骨细胞后，能够促进软骨细胞向肥大软骨细胞分化，并且具有接近天然软骨钙化层的抗压强度。本专利技术在钙化层中加入煅烧骨这种生物相容性好、成骨效果稳定的骨修复材料，能够在修复软骨缺损的同时，再生软骨下骨，有利于钙化层与软骨下骨层的融合；并可以通过煅烧骨与冻干软骨基质比例的调整改变钙化层的抗压强度及可塑性。例如，当煅烧骨粉与冻干软骨基质溶液的质量体积比小于O. 2g/ml 时，所制备的钙化层，经复水后柔韧度高，可根据缺损部位形状任意塑形，便于临床操作。步骤三、中层的制备将冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原溶于体积浓度为 I %的醋酸溶液中，使终浓度分别为5 12mg/ml、4 10mg/ml、2 5本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚瑶，
申请(专利权)人：陕西博鸿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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