硬脑/脊膜移植替代物的制备方法及其装置制造方法及图纸

一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法，本发明专利技术是将膜组织反复冻融、辗压破裂细胞、交联固定保护、脱细胞去抗原、致密面纤维化修饰及包装灭菌后获得；具有方法简单、原料来源广泛低廉、成本低的优点；所制备的膜替代物在保护膜组织天然结构和性能的同时彻底去除细胞成分和其他抗原成分，生物相容性好、无免疫排斥、安全可靠、力学性能好，易于临床手术操作，能满足缺损修复的需要，疏松面有利于组织液的吸附、活性因子的富集、血管和细胞的长入，有促进组织再生功能；并具有与宿主融合快、可降解吸收、修复效果好的优点；经动物试验表明，使缺损得到完全修复，未见脑/脊液渗漏，未与脑组织发生粘连，未发现明显的排斥反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于组织工程学医用生物材料
，具体涉及一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法及其装置。
技术介绍
硬脑膜和硬脊膜分别是大脑与颅骨、脊柱与脊髓之间重要的功能膜组织，具有相同的生物学特征和功能。硬脑膜贴附颅腔内面，与颅盖连结疏松，与颅底结合紧密；硬脑膜在脑神经出颅处向外延伸，移行而与神经的被膜结合，在枕骨大孔周缘向下延为硬脊膜。开放性创伤、炎症、肿瘤或其他脑颅脊柱疾病等均会引起硬脑/脊膜的损伤。硬脑/脊膜的破损往往又会引起癫痫、脊液外漏、颅内感染、脑膜膨出、脑功能障碍等病症。硬脑/脊膜成形术是解决硬脑/脊膜损伤的临床方式，需要采用移植替代物植入缺损部分进行修复。因此，硬脑/脊膜移植替代材料的研发至关重要。本申请中所称硬脑/脊膜即指硬脑膜和硬脊膜 (硬脑膜和硬脊膜的功能和结构都是一致，硬脑膜是保护脑组织，硬脊膜是保护脊髓组织，二者连接为一体)。目前采用自体筋膜移植修复硬脑/脊膜仍是临床应用的标准，但存在有来源受限、术后早期脑脊液渗漏发生率高、易粘连、供区不愈合等缺点。尸体来源的硬脑膜材料也曾被用于硬脑/脊膜修复，但由于捐献者少，一个材料仅能用于4 5例患者移植修复，市场化困难；更重要的是，尸体来源的材料具有引起病毒传染的高风险，如克雅氏病(CJD)。1987年自美国发现第一例因为采用尸体来源的硬脑膜而患CJD致死的患者，后又在全世界范围内陆续出现62名类似患者，美国食品药品监督管理局(FDA)对此类产品进行了严厉处置。高分子聚合物材料也被大量地研究用于硬脑/脊膜修复，根据降解性能分为可降解高分子聚合材料和不可降解聚合材料，例如不可降解的聚四氟乙烯(PTFE)，可降解的聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)等及其共聚物。中国专利文献101878048A公开了一种丙交酯/ e -己内酯共聚物人工硬脑膜的制造方法；美国专利20070233275公开了一种聚乳酸(PLA)/乙醇酸(GA) /己内酯(CL)三元共聚物硬脑膜修复材料的制备方法。无论是可降解或是不可降解的高分子聚合材料，均存在有以下缺陷可降解聚合材料降解后往往会产生酸性微环境，引起严重的炎症反应，影响修复效果；不可降解的聚合材料对于受体来说永远是异物，易导致炎症反应、结缔组织增生包裹、感染、出血等。Protasoni M.等(J Neurosurg 114 :1723-1730, 2011)研究了人体硬脑膜的胶原架构特征，发现人体硬脑膜具有五层结构1)与颉骨接触的骨表面层(Bone surfacelayer) ；2)外中间层(External Median Layer) ；3)血管层(Vascular Layer) ；4)内中间层(Internal Median Layer) ；5)蛛网膜层(Arachnoid Layer)。每个结构层的胶原纤维具有特殊的取向和不同的搭配编制模式，具有不同的功能。这一发现对人工硬脑膜材料的研发具有重要的启发意义。因为动物膜组织同样具有类似的多层功能结构和胶原架构，以此开发硬脑/脊膜移植替代物是可行的。大量的研究被用于开发异种脱细胞基质硬脑/脊膜修复材料。这类材料来源广泛，例如哺乳动物的皮肤组织、筋膜、心包膜、腹膜、隔膜、小肠粘膜等。现有的脱细胞基质材料的制备方法主要是通过脱细胞去抗原、或封闭抗原和交联固定等工艺完成。美国专利5413798公开了一种硬脑膜替代材料的制备方法及其应用。该材料是以牛心包膜为原料，经过湿化学处理、漂白、轻洗、脱脂、冻干和灭菌等工艺制备。经动物试验显示该材料具有良好的生物相容性和硬脑膜修复效果，但是临床实验发现该材料仍有粘连现象发生。中国专利申请200510120796. 5公开了一种动物组织经过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂封闭抗原处理获得的可用于修复的生物型硬脑膜。尽管该专利宣称动物组织经过碱处理、脱脂、交联固定和封闭抗原处理，可以达到去抗原目的；但是，其对动物组织中的细胞如何处理没有说明，若只通过封闭抗原处理，则细胞成分引起免疫反应的风险是很大的；尽管通过交联固定可以改变材料的降解性能，达到“被动式”降解，但人体硬脑膜和动物膜组织都具有独特的多层结构，这样整体交联后势必造成不同结构层的趋同化，会引起一些功能的消退；此外，随着材料的降解，被封闭的抗原会再次裸露，有引起免疫排斥的危险。一些实验研究发现，这种经过交联固定处理的材料在动物体内长时间不降解，与组织再生 并不匹配，生物相容性差。总之，现有方法都需要采用各种化学试剂、交联剂、酶等脱细胞处理，在处理过程中会破坏材料的天然结构，降低使用性能，如材料的降解性能、力学性能等；或者脱细胞去抗原不彻底，或者材料植入体内后由于降解致使被封闭的抗原重新裸露，引起严重的免疫反应。大量临床实验发现，这类材料会与脑组织发生粘连，长期效果有待进一步验证。因此，现有的脱细胞去抗原技术还未达到理想要求。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法及其装置，使所制备的硬脑/脊膜移植替代物具有致密面和疏松面以及膜组织的天然结构，并有效去除细胞及抗原成分，其生物相容性好、无免疫排斥、使用安全可靠、柔韧力学性能好。本专利技术所提出硬脑/脊膜移植替代物的制备方法，包括以下步骤步骤一、将膜组织在-20 _80°C温度下冷冻2 24小时，初步破碎膜组织中的细胞，在室温下解冻，如此反复冻融I 3次；所述的膜组织为哺乳动物的心包膜、腹膜、隔膜、硬脑膜和小肠黏膜的任一种；步骤二、将冻融后的膜组织采用辗压进一步破裂细胞，辗压是以空气或是液体为环境媒介，可以在常压、或是真空、或是压力的环境中进行；辗压的压力为5MPa 50Mpa，优化值为IOMPa 20Mpa ;所述液体媒介可以选择纯化水、生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)或是Tris缓冲液的任一种。由于天然动物膜组织的表面结构一面疏松一面致密，具有不同的生理功能，在脱细胞去抗原处理时，保持其固有的结构特点至关重要；因此在去抗原处理前需通过交联固定对膜组织表面进行保护；步骤三、将辗压后的膜组织进行交联固定保护对膜组织的疏松面不交联，或是以< 2小时的紫外光照射交联；而对膜组织的致密面，采用物理交联或化学交联、或是二者复合的方式；其中物理交联为2 12小时的紫外光照射，优化选择为4 6小时；物理交联也可以是有机溶剂脱水交联，所述的有机溶剂为乙醇、或丙酮、或异丙醇；化学交联可以采用异氰酸盐类(HDI)、或酰基叠氮类(DPPA)、或醌类(NDGA)、或碳化二亚胺(EDC)、或环氧化合物(EC)及其低聚物、或聚乙二醇为化学交联剂，或是采用葡萄糖、或核糖为生物交联剂；交联剂的优化选择为EDC或D-核糖。采用EDC交联的方法为，以乙醇、或异丙醇、或丙酮与磷酸盐缓冲液(PBS)的混合溶液为溶媒，其中有机试剂占溶媒总体积的30 50%;再以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为稳定剂，EDC的浓度为5mM 20mM，NHS的用量是EDC的1/4 1/3，交联温度为2 10°C，交联时间16 36h ;采用D-核糖交联的方法为，以乙醇、或异丙醇、或丙酮与水的混合溶液为溶媒，有机试剂占溶媒总体积的60 80%，D-核糖浓度为0. 3mM 3mM，交联温度为20 40°C，交联时间3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将膜组织在？20～？80℃温度下冷冻2～24小时后，于室温下解冻，如此反复冻融1～3次；所述的膜组织为哺乳动物的心包膜、腹膜、隔膜、硬脑膜和小肠黏膜的任一种；步骤二、将冻融后的膜组织采用辗压破裂细胞，辗压是以空气或是液体为环境媒介进行；辗压压力为5MPa～50Mpa；步骤三、将辗压后的膜组织进行交联固定保护：对膜组织的疏松面不交联，或是以＜2小时的紫外光照射交联；对膜组织的致密面，采用物理交联或化学交联、或是二者复合方式；其中：物理交联为2～12小时的紫外光照射，或是采用乙醇、或丙酮、或异丙醇的脱水交联；化学交联是采用HDI、或DPPA、或NDGA、或EDC、或EC及其低聚物、或聚乙二醇为化学交联剂，或是采用葡萄糖、或核糖为生物交联剂，进行交联反应；步骤四、脱细胞去抗原：对交联后膜组织的两个表面采用不同方式脱细胞去抗原处理，对疏松面的处理强度相对致密面要温和；步骤五、致密面的纤维化修饰：采用磷酸盐与碱的混合溶液对膜组织致密面进行纤维化修饰处理；所述的磷酸盐为磷酸氢二钠或磷酸钾，浓度为0.1～0.5M，所述的碱为氢氧化钠、或氢氧化钾、或氢氧化锂、或氢氧化钙、或是氨水，浓度为0.01～0.1M；所述的混合溶液pH≥11，处理温度2～25℃，处理时间6～48小时；得到硬脑/脊膜移植替代物产品；在混合溶液处理后，允许再采用丙酮、乙醇、异丙醇有机试剂进行致密化处理；步骤六、包装及灭菌：将所得产品经干燥、裁切、包装、灭菌后储存。...

【技术特征摘要】
1.一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一、将膜组织在-20 -80°c温度下冷冻2 24小时后，于室温下解冻，如此反复冻融I 3次；所述的膜组织为哺乳动物的心包膜、腹膜、隔膜、硬脑膜和小肠黏膜的任一种； 步骤ニ、将冻融后的膜组织采用辗压破裂细胞，辗压是以空气或是液体为环境媒介进行；辗压压カ为5MPa 50Mpa ； 步骤三、将辗压后的膜组织进行交联固定保护对膜组织的疏松面不交联 ，或是以< 2小时的紫外光照射交联；对膜组织的致密面，采用物理交联或化学交联、或是二者复合方式；其中物理交联为2 12小时的紫外光照射，或是采用こ醇、或丙酮、或异丙醇的脱水交联；化学交联是采用HDI、_DPPA、_NDGA、_EDC、_EC及其低聚物、或聚こニ醇为化学交联剂，或是采用葡萄糖、或核糖为生物交联剂，进行交联反应； 步骤四、脱细胞去抗原对交联后膜组织的两个表面采用不同方式脱细胞去抗原处理，对疏松面的处理强度相对致密面要温和； 步骤五、致密面的纤维化修饰采用磷酸盐与碱的混合溶液对膜组织致密面进行纤维化修饰处理；所述的磷酸盐为磷酸氢ニ钠或磷酸钾，浓度为O. I O. 5M，所述的碱为氢氧化钠、或氢氧化钾、或氢氧化锂、或氢氧化钙、或是氨水，浓度为O. 01 O. IM ;所述的混合溶液pH彡11，处理温度2 25°C，处理时间6 48小时；得到硬脑/脊膜移植替代物产品；在混合溶液处理后，允许再采用丙酮、こ醇、异丙醇有机试剂进行致密化处理； 步骤六、包装及灭菌将所得产品经干燥、裁切、包装、灭菌后储存。2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述步骤ニ中，辗压压カ为IOMPa 20Mpa ;所述液体媒介为纯化水、生理盐水、PBS缓冲液或是Tris缓冲液的任ー种。3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，物理交联的紫外光照射为4 6小时。4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，化学交联剂为EDC或D-核糖；采用EDC的交联方法为，以こ醇、或异丙醇、或丙酮与磷酸盐缓冲液的混合溶液为溶媒，有机试剂占溶媒总体积的30 50%;以NHS为稳定剂，EDC的浓度为5mM 20mM，NHS的用量是EDC的1/4 1/3，交联温度为2 10°C，交联时间16 36h ;采用D-核糖的交联方法为，以こ醇、或异丙醇、或丙酮与水的混合溶液为溶媒，有机试剂占溶媒总体积的60 80%，交联剂浓度为O. 3mM 3mM，交联温度20 40°C，交联时间3 15天。5.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四中脱细胞去抗原的处理为 对于...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄文涛，
申请(专利权)人：陕西博鸿生物科技有限公司，
类型：发明
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