本发明专利技术涉及一种脱细胞心包材料的制备方法，包括：（1）取健康成年动物的心脏，割取心包膜，然后反复冲洗所得心包膜，在无菌条件下剥离外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为片状，充分漂洗后得到处理后的包心组织；（2）将上述处理后的心包组织加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通过低渗处理或高渗处理，再经过核酶处理，最后清洗即可。本发明专利技术的制备方法简单，原料来源广泛，成本低，便于批量生产，所用的表面活性剂烷基糖苷无毒无害，且能彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片；本发明专利技术得到的脱细胞基质的免疫原性大幅降低且细胞毒性低，生物相容性好，具有较好的力学性能和生物学特性，是一种良好的组织工程支架材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于心包材料的制备领域，特别涉及。
技术介绍
组织工程研究是制造人体器官和组织的科学，由于其广阔的应用前景和逐年以几何级数递增的产业效益，各国政府和产业界都投入 巨资进行研究和产业建设。世界毎年的研究经费都在几十亿美元以上。组织工程研究包括两个主要方面一方面是用来构建成器官和组织形态的支架；另一方面是种植在支架上可以生长并发挥生 理作用的细胞。而对于组织工程支架，它必须具备两个特点(I)对细胞具有良好的亲和性；(2)对人体无毒害、无免疫反应，可在人体内降解。细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)是各种组织器官的主要组成成分,构成了各种组织器官的三维空间结构和营养物质的储存，其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含的多种生长因子在组织修复和重建中有重要促进作用，即使经过脱细胞处理仍有活性，是细胞生长的理想环境，这是其他人エ聚合物(如胶原、壳聚糖、聚乳酸和聚羟基こ酸等)所不能比拟的。心包是包裹心和出入心大血管根部的纤维浆囊膜，可分为纤维层、浆膜层和外结缔组织层，主要由细胞和ECM组成，其中的细胞成分作为抗原被宿主识别后会引发炎症或免疫排斥反应，需要通过脱细胞处理来去除抗原物质，ECM由I、111型纤维胶原蛋白构成，含有少量的弾性纤维、氨基聚糖和糖蛋白等，其组分在不同物种间通常是受保护的而且耐受性良好，是ー种理想的组织工程生物支架材料。目前脱细胞处理方法主要包括物理法、化学法和酶处理法。物理的处理方法有很多，主要是通过物理的作用如冻融、液体高压、超声波和电击等脱除细胞，但物理方法对ECM的破坏作用较大。化学方法就是使用ー些特定的化学试剂如酸、碱和去污剂等破碎细胞达到去除细胞的目的，但化学试剂的残留会对机体产生毒害作用。酶处理方法主要是指用酶试剂来裂解细胞，例如脱细胞方法中通常会用到胰蛋白酶，但胰蛋白酶对ECM有降解的作用。且这些脱细胞方法过程繁琐，处理时间长，不利于批量生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，该方法筒单，成本低，彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片，制备出具有较好的力学性能和生物学特性的生物支架材料。本专利技术的，包括(I)前置处理取健康成年动物的心脏，割取心包膜，热缺血时间小于I小时；然后在0-37°C下用无菌的生理盐水或pH值为6. 8-8. 6的磷酸盐缓冲液反复冲洗所得心包膜，以去除血凝块后，在无菌条件下剥离外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为片状，用无菌的生理盐水或PH值为6. 8-8. 6的磷酸盐缓冲液充分漂洗，得到处理后的包心组织；(2)脱细胞处理及清洗将上述处理后的包心组织加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通过低渗处理或高渗处理，破坏细胞膜结构和抽提细胞膜的脂质和膜蛋白；再经过核酶处理，以降解细胞中各类DNA和/或RNA成分，最后清洗即可。步骤(I)中所述的成年动物为猪或牛。步骤(I)所述的片状的尺寸为6cmX8cm。步骤(I)得到的处理后的包心组织于4°C下保存在含双抗溶液的无菌的生理盐水中。上述的双抗溶液为100倍工作浓度的青霉素和硫酸链霉素溶液(配制的双抗溶液为100倍的浓缩液，实际工作浓度为稀释100倍后的浓度，青霉素的工作浓度范围为50-5000U/ml，硫酸链霉素的工作浓度范围为1-lOOmg/ml)。 步骤(2)中所述的含有烷基糖苷APG的溶液中APG的体积浓度小于50%。上述的烷基糖苷(也称为烷基葡萄糖苷、烷基多糖甘)通常为50%含量的水溶液，有0810、0814、1214、0816、1216、1618等型号，可以是烷基糖苷系列中的任ー种或ー种以上。步骤(2)中所述的低渗处理为采用浓度为O. OlM且pH值为6. 8_8. 6的无菌的Tris-HCI缓冲液，在1°C _25°C中振荡处理1_96小时，振荡速率为80_360rpm。步骤(2)中所述的高渗处理为采用浓度为0.05M且pH值为6. 8-8. 6的无菌的Tris-HCI缓冲液，在1°C _25°C中振荡处理1_96小时，振荡速率为80_360rpm。步骤(2)中所述的核酶处理为在37°C下，在含有lOO-lOOOOu/ml的脱氧核糖核酸酶(DNase)、100-10000u/ml 核糖核酸酶(RNase)、0. 15M NaCl、l_5mM MgCl2 的无菌的 0. 05MTris-HCl缓冲液(pH 6. 8-8. 6)中，于60_360rpm转速下振荡处理6_72小时；其中所述的双抗为青霉素和硫酸链霉素。步骤(2)中所述的清洗是指用无菌的生理盐水或pH值为6. 8-8. 6的磷酸盐缓冲液在1°C -25°C条件下对所得脱细胞基质进行清洗，清洗时间为6-48小吋。上述的无菌的生理盐水或pH值为6. 8-8. 6的磷酸盐缓冲液中含有抗生素。经过ー下多项实验证实，本专利技术得到的脱细胞心包材料效果好，达到了专利技术的目的I.残留细胞脱细胞猪心包经常规苏木素一伊红染色，证实无细胞结构存在。(图2)2.基质纤维结构脱细胞猪心包经Weigert染色，可观察到经本专利技术的脱细胞方法处理后，猪心包组织中的胶原纤维排列整齐，无明显断裂，仍呈波浪状平行排列，结构紧凑，弾性纤维结构清晰。(图4)3.脱细胞基质DNA含量的測定经DNA检测试剂盒测得未脱细胞的猪心包DNA含量是607. 34±47. 26ng/mg干重组织，经过本专利技术的脱细胞处理后的DNA含量为8.24±1. 31ng/mg干重组织，统计学分析有显著差异，证实本专利技术的脱细胞方法能显著降低组织核酸含量，进ー步说明该方法能完全去除细胞。4.脱细胞基质含水量的测定新鲜猪心包组织的含水量是77. 75±0. 57%，经脱细胞处理后的猪心包组织的含水量是83. 98±1.64%，统计学处理无显著差异。5.胶原蛋白含量測定由测得羟脯氨酸換算得未脱细胞的猪心包组织的胶原蛋白含量是48. 34±1. 01%，经脱细胞处理的猪心包组织的胶原蛋白含量是47. 6±0. 67%，统计学处理无显著差异。6.弾性蛋白含量測定由猪a_弾性蛋白试剂盒測定的未脱细胞的猪心包组织的弹性蛋白含量是O. 233±0. 0128 μ g/g,经脱细胞处理的猪心包组织的弹性蛋白含量是O.129±0. 0132 μ g/g,统计学处理无显著差异。7.力学性能检测(1)拉伸强度的测定在万能材料试验机上测得基质材料的拉伸强度，新鲜猪心包的最大拉伸强度为19. 92±1. 94MPa，经脱细胞处理的猪心包的最 大拉伸强度为15.9±0.81MPa，统计学处理无显著差异。(2)断裂伸长率的測定在万能材料试验机上测得基质材料的断裂伸长率，新鲜猪心包的断裂伸长率为65. 54±3. 96%，经脱细胞处理的猪心包的断裂伸长率为76. 48±1. 23%，统计学处理有显著差异。(3)弹性模量的測定在万能材料试验机上测得基质材料的弹性模量，新鮮猪心包的弾性模量为77. 17±4. 77MPa，经脱细胞处理的猪心包的弹性模量为73. 56±3. 8MPa，统计学处理无显著差异。由此证实本专利技术的脱细胞方法对基质的力学性能影响较小，能够保持支架材料的机械性能。8.体外细胞毒性检测根据浸提液和MTT的方法测得未脱细胞的猪心包组本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种脱细胞心包材料的制备方法，包括 (1)取健康成年动物的心脏，割取心包膜，热缺血时间小于I小时；然后在0-37°C下用无菌的生理盐水或PH值为6. 8-8. 6的磷酸盐缓冲液反复冲洗所得心包膜，在无菌条件下剥离外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为片状，用无菌的生理盐水或PH值为6.8-8. 6的磷酸盐缓冲液充分漂洗，得到处理后的包心组织； (2)将上述处理后的心包组织加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通过低渗处理或高渗处理，再经过核酶处理，最后清洗即可。2.根据权利要求I所述的ー种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于步骤(I)中所述的成年动物为猪或牛。3.根据权利要求I所述的ー种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的片状的尺寸为6cmX8cm。4.根据权利要求I所述的ー种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于步骤(I)得到的处理后的包心组织于4°C下保存在含双抗溶液的无菌的生理盐水中。5.根据权利要求4所述的ー种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于所述的双抗溶液为100倍工作浓度的青霉素和硫酸链霉素溶液,其中青霉素的工作浓度范围为50-5000U/ml，硫酸链霉素的工作浓度范围为l-100mg/ml。6.根据权利要求I所述的ー种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的含有烷基糖苷APG的溶液中APG的体积浓度小于50% ;所述的烷基糖苷为0810、0814、12...
【专利技术属性】
技术研发人员：莫秀梅，董教明，李雨，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：
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