通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途技术

通用型CAR‑T细胞及其制备方法和用途。本发明专利技术提供了一种通用型CAR‑T细胞，其表达特异性CAR并且不表达TCR。本发明专利技术还提供了一种制备通用型CAR‑T细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1)在T细胞中引入sgRNA分子和Cas9分子；2)在所述T细胞中引入CAR分子；其中，步骤2)可在步骤1)之前、之后或同时进行，并且所述sgRNA分子包含与来自TCR的a链或β链恒定编码区(即TRAC或TRBC)基因的靶区域互补的靶向结构域。本发明专利技术的通用型CAR‑T细胞避免了转导的T细胞出现GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰。

【技术实现步骤摘要】
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本专利技术涉及免疫学和分子生物学领域，具体地涉及肿瘤免疫疗法，尤其是一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途。·
技术介绍
肿瘤免疫疗法近年来得到广泛的关注和应用，尤其是CAR-T(chimericantigenreceptor-engineeredTcells)技术的出现，使人类对肿瘤的控制得到了里程碑式的发展。该技术在肿瘤治疗中的应用始于1989年。它的临床应用结果让人看到治愈癌症的曙光：不仅仅在急性或者慢性淋巴细胞血液病中可以创造奇迹，在其它一些实体瘤比如淋巴瘤、成神经细胞瘤中也有着令人兴奋的治疗效果。目前CAR-T技术中所应用的T细胞主要来源于患者自身，从患者自身外周血来源的T细胞经过激活、CAR导入并扩增，然后回输到患者体内。但是很多情况下，由于病人的病情危险或者患者自身的条件不允许再从其体内抽出外周血进行CAR-T细胞的治疗；甚至是即使病人可以提供外周血，但是从血中分选出来的T细胞活性不足以进行CAR改造，这就从一定范围上限制了CAR-T技术的应用范围。为了解决这个问题，异体CAR-T逐渐成为一个良好的选择。同时，异体CAR-T技术解决了T细胞的来源问题也将为CAR-T的商业化推广奠定基础。在机体内，T细胞捕获并消灭异源抗原是一个复杂的过程，需要主要组织相容性复合物(MHC)和T细胞受体(TCR)的共同参与，其中TCR在识别MHC结合的抗原过程中起着关键作用。主要组织相容性复合物(MHC)有两种类型，通常称为MHCI类和MHCII类，除了具有抗原递呈作用，还与器官移植过程中的排斥反应相关。杀伤性T细胞则是通过其表面具有的类似抗体的分子即T细胞受体(TCR)识别并清除经MHCI类分子递呈的抗原。在同种异体环境中，CAR-T上的TCR信号传导作用可能对临床应答产生潜在的影响，而TCR和CAR之间的相互作用尚未有深入的研究。同时，回输异体CAR-T细胞有可能出现移植物抗宿主病(GVHD)的风险。因此，需要有降低受体的供体细胞排斥反应和避免出现GVHD的改善CAR-T疗效的方法。·
技术实现思路
本专利技术针对上述缺陷，利用CRISPR/Cas9技术对来自健康志愿者(donor)的T细胞进行修饰，选择性敲除内源性T细胞受体(TCR)的a链和/或β链恒定编码区(TRAC和/或TRBC)基因，同时将嵌合抗原受体(CAR)稳定表达在T细胞中，从而获得了表达特异性CAR同时不表达TCR的CAR-T细胞。本专利技术的第一方面提供了一种通用型CAR-T细胞，其表达特异性CAR并且不表达TCR。本专利技术的第二方面提供了一种制备通用型CAR-T细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1)在T细胞中引入sgRNA分子和Cas9分子；2)在所述T细胞中引入CAR分子；其中，步骤2)可在步骤1)之前、之后或同时进行，并且所述sgRNA分子包含与来自TCR的a链或β链恒定编码区(即TRAC或TRBC)基因的靶区域互补的靶向结构域。本专利技术的第三方面提供了包含本专利技术第一方面的通用型CAR-T细胞的组合物。本专利技术的第四方面提供了本专利技术第一方面的通用型CAR-T细胞用于制备治疗肿瘤的药物的用途。本专利技术的通用型CAR-T细胞避免了输注到患者体内的T细胞出现GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰。本申请将会为通用型CAR-T细胞的使用铺平道路，具有重大的临床意义。·附图说明根据以下参照附图进行的详细描述，本专利技术的上述和其他方面、特征和优点会变得更加清楚。图1示出了sgRNA表达质粒及Cas9表达质粒在不同转染(脂质体转染、电转和慢病毒转染)条件下的转染效率的比较结果。图2a和图2b示出了不同sgRNA造成基因组突变的效率的比较结果。图3示出了对经TCR敲除的TRAC和TRBC区域进行测序的结果。图4示出了对预测的TRAC-sg3潜在的人基因组上的脱靶位点进行测序的结果。图5示出了对TCR阴性、CD4和CD8阳性的T细胞的筛选结果。图6示出了T细胞、WTCAR-T和TCR-CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果的比较结果。图7示出了T细胞、WTCAR-T和TCR-CAR-T细胞抑制以及杀死肿瘤细胞的效果的比较结果。图8示出了注射小鼠T细胞、人WTCAR-T和人TCR-CAR-T细胞后，小鼠平均体重的变化的比较结果。·具体实施方式如上所述，本专利技术的第一方面提供了一种通用型CAR-T细胞，其表达特异性CAR并且不表达TCR。在一个实施方案中，所述细胞来源于健康志愿者(或供者)。在一个实施方案中，本专利技术的通用型CAR-T细胞的TCR基因被敲除。在一个具体的实施方案中，所述TCR的a链和/或β链恒定编码区(即TRAC和/或TRBC)基因被敲除。TRAC和TRBC基因可以被全部敲除，也可以被部分敲除；可以二者均被敲除，也可以敲除二者之一；只要敲除后细胞不能表达有活性的TCR即可。在一个具体的实施方案中，所述TCR的a链恒定编码区(即TRAC)基因被敲除。例如，在具体实施方案中，本专利技术TCR的a链恒定编码区基因被引入所述细胞的TRAC-sg1-7分子之一(见表1)以及Cas9分子部分或全部敲除；优选，所述TCR的a链恒定编码区基因被引入细胞的TRAC-sg3分子以及Cas9分子敲除。在另一个具体的实施方案中，所述TCR的β链恒定编码区(即TRBC)基因被敲除。例如，在具体实施方案中，本专利技术TCR的β链恒定编码区基因被引入所述细胞的TRBC-sg1-7分子之一(见表1)以及Cas9分子部分或全部敲除；优选，所述TCR的β链恒定编码区基因被引入细胞的TRBC-sg1分子以及Cas9分子敲除。在一个实施方案中，本专利技术的通用型CAR-T细胞所表达的CAR可以是本领域已知的任何CAR，只要其能够使T细胞以人白细胞抗原-非依赖性的方式识别细胞表面抗原，发挥杀伤作用即可。例如，可以使用中国专利技术专利申请201510324558.X中公开的CAR，本专利技术的具体实施方案中使用的CAR可参考该专利技术专利申请公开文本。具体而言，本专利技术的CAR-T细胞中表达的CAR包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、任选的铰链区、跨膜区和胞内信号区。本文使用的术语“信号肽”是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链。在本专利技术中，可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，例如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。在一个具体的实施方案中，所述信号肽为GMCSF信号肽，其核苷酸序列如专利技术专利申请201510324558.X的序列表中的SEQIDNo:1所示。在一个具体的实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽，其核苷酸序列如专利技术专利申请201510324558.X的序列表中的SEQIDNo:2所示。在本专利技术中，所述铰链区可以使用各种不同抗体或抗原受体的铰链区，特别是CD分子的铰链区。在一个具体的实施方案中，所述铰链区可以选自CD8或CD28等蛋白的铰链区。所述CD8或CD28是T细胞表面的天然标记物。在一个具体的实施方案中，所述铰链区为CD8铰链区(CD8-hinge)，其核苷酸序列如专利技术专利申请201510324558.X的序列表中的SEQIDNo:6所示。在一个具体的实施方案中，所述铰链区为CD28铰链区(CD28-hinge)，其核苷酸序列如专利技术专利申请2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通用型CAR‑T细胞，其表达特异性嵌合抗原受体(CAR)并且不表达T细胞受体(TCR)。

【技术特征摘要】
1.一种通用型CAR-T细胞，其表达特异性嵌合抗原受体(CAR)并且不表达T细胞受体(TCR)。2.权利要求1的通用型CAR-T细胞，其中所述细胞来源于健康志愿者(或供者)。3.权利要求1或2的通用型CAR-T细胞，其中所述TCR的编码基因被敲除；优选地，所述TCR的a链和/或β链恒定编码区(即TRAC和/或TRBC)基因被敲除；更优选地，所述TCR的a链和/或β链恒定编码区基因被引入所述细胞的TRAC-sg1-7分子之一和/或TRBC-sg1-7分子之一以及Cas9分子敲除；最优选地，所述TCR的a链和/或β链恒定编码区基因被引入细胞的TRAC-sg3分子和/或TRBC-sg1分子以及Cas9分子敲除。4.权利要求1-3中任一项的通用型CAR-T细胞，其中所述CAR包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、任选的铰链区、跨膜区和胞内信号区；优选地，所述信号肽的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中SEQIDNo:1或SEQIDNo:2所示；优选地，所述胞外结合区的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中SEQIDNo:4或SEQIDNo:5所示；优选地，所述铰链区的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中SEQIDNo:6或SEQIDNo:7所示；优选地，所述跨膜区的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中SEQIDNo:8或SEQIDNo:9所示；优选地，所述胞内信号区的核苷酸序列如发明专利申请201510324558.X的序列表中SEQIDNo:10、SEQIDNo:11或SEQIDNo:12所示。5.权利要求4的通用型CAR-T细胞，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：何霆，鲁薪安，尤亚南，胡雪莲，
申请(专利权)人：北京艺妙神州医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11