检测CAR-T细胞的捕获探针、该细胞含量的检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测CAR-T细胞的捕获探针、该细胞含量的检测方法及应用。所述捕获探针包括能够结合在CAR-T细胞的配体，以及结合在该配体上的荧光分子。该检测方法包括以下步骤：将待检样本中加入结合有荧光分子的配体进行混合，使得配体结合在待检样本中的CAR-T细胞上；然后离心并弃去上清，保留沉淀物；将沉淀物重悬后进行流式检测，获得CAR-T细胞含量。该探针及其检测方法可快速准确地实现CAR-T细胞的检测，为CAR-T监测、预后提供有力保障。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种检测CAR-T细胞的捕获探针、该细胞含量的检测方法及应用。
技术介绍
CAR-T，即ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，全称为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞)是通过将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。更为具体的，在实施的过程中，CAR-T治疗流程包括采集患者外周血、分离T细胞、将CAR导入T细胞、质量控制以及将细胞回输至患者。其中，CAR是一段嵌合基因，表达后为一个跨膜蛋白。CAR表达产物的胞外区是源自抗体Fab区的一段序列，可以识别癌细胞抗原，从而保证T细胞对靶细胞实施精准的清除。当CAR-T细胞识别靶细胞后，CAR表达产物的胞内区可以迅速激活T细胞的杀伤活性，进而导致靶细胞凋亡和裂解。对于CAR-T疗法，近年来，其在多个临床试验中展现出了极佳的治疗效果，是非常具有潜力的癌症治疗新途径。在一项针对难治急性淋巴细胞白血病的临床试验中，CAR-T疗法使90％(27/30)的受试者得到完全缓解(NEnglJMed2014；371:1507-17.)。在另一项针对成人难治急性淋巴细胞白血病的临床试验中，CAR-T疗法使88％(14/16)的受试者得到完全缓解(ScienceTranslationalMedicine2014；6:224)。此外，还有数十个针对多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌等疾病的CAR-T疗法正在临床试验中。未来，CAR-T疗法有望成为多种晚期癌症治疗的重要方法，临床意义和市场价值巨大。然而，CAR基因能否表达、表达效率的高低、CAR-T细胞的活性和纯度都会直接影响CAR-T细胞对癌细胞的清除效率。临床研究证明，CAR-T细胞回输后在患者外周血中的增殖能力与疗效具有很强的相关性(ScienceTranslationalMedicine2015；7:303)。目前，主流的临床试验采用实时荧光定量PCR的方法检测外周血基因组中的CAR含量，进而间接估算CAR-T细胞数量。但是，问题在于，只有成功表达的CAR才能发挥作用，而基因组中的CAR含量与CAR的表达水平并不直接相关。此外，CAR在基因组中的拷贝数与载体特征、病毒滴度、细胞状态等都有关系，会进一步导致通过检测外周血基因组中的CAR含量估算CAR-T细胞的误差。因此，准确、快速的检测CAR含量对于该疗法的实施、监测以及预后具有关键意义。有鉴于此，特突出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测CAR-T细胞的捕获探针，以解决现有技术中通过检测基因组中CAR含量进而间接估算CAR-T细胞数量所存在的误差大，检测结果不准确的技术问题。本专利技术的第二目的在于提供一种利用该捕获探针流式检测CAR-T细胞含量的方法，以解决现有检测方法检测速度慢，结果不可靠的技术问题；该方法可快速准确地实现CAR-T细胞的检测，为CAR-T监测、预后提供有力保障。本专利技术的第三目的在于提供上述的捕获探针的用途，以实现其在检测CAR-T细胞含量、制备用于检测CAR-T细胞含量的产品(如相应的试剂盒)中的应用价值。为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种检测CAR-T细胞的捕获探针，所述捕获探针包括能够结合在CAR-T细胞的配体，以及结合在该配体上的荧光分子。在本专利技术中，捕获探针主要包括可以识别并结合在CAR-T细胞的配体；由于该配体可以有效地结合在CAR-T细胞上，具体为结合到CAR分子(应理解，此处的CAR分子是CAR基因的表达产物)的scFv结构域上，进而可起到捕获CAR-T细胞的作用，另一方面由于该配体还可以与荧光分子结合，进而通过流失细胞仪即可快速准确地对CAR-T细胞定量。通过该捕获探针，可实现CAR-T细胞的直接定量检测，而且通过优选配体，增大其与CAR分子的结合率，从而准确快速地实现CAR-T细胞的定量检测；与传统的通过基因组中所含CAR基因的检测(基因组中的CAR含量与CAR的表达水平并不直接相关，而只有成功表达的CAR才能发挥作用)并间接估算CAR-T细胞的方式相比，还直接避免了载体特征、病毒滴度、细胞状态等因素可能会导致的估算误差。优选的，所述配体包括第一配体和第二配体；所述第一配体能够结合在CAR分子scFv结构域上；且第一配体还能结合有生物素；所述第二配体能够识别所述生物素，且所述荧光分子能够结合在所述第二配体上。上述的方案中，对配体进行进一步的细化，第一配体其可以结合在CAR分子scFv结构域上，而且还可以稳定地被生物素标记，而第二配体可识别生物素，从而起到捕获作用，且第二配体可被荧光分子标记，以实现流式定量检测。优选的，所述第一配体包括能够结合在IgG的lightchain或者heavychain上的蛋白；和/或所述第二配体为能够结合生物素的蛋白或多肽，所述荧光分子包括FITC、PE、PE-CYx、APC中的任一种。优选的，所述第一配体包括ProteinL、ProteinA、ProteinG以及该几种蛋白的变体；和/或所述第二配体为链霉亲和素。上述方案中，通过优选的配体蛋白、荧光分子从而实现捕获探针与被检测细胞更好的结合效果，以进一步提高检测的准确性。其中，ProteinL、ProteinA、ProteinG以及它们的变体，均能结合在IgG的lightchain或者heavychain上，因此能结合到CAR分子的scFv结构域上；链霉亲和素可以有效地结合生物素等亲和素分子。一种基于流式检测CAR-T细胞含量的方法，包括以下步骤：将待检样本中加入结合有荧光分子的配体进行混合，使得配体结合在待检样本中的CAR-T细胞上；然后离心并弃去上清，保留沉淀物；将沉淀物重悬后进行流式检测，获得CAR-T细胞含量。在检测方法中，预先结合有荧光分子的配体与待检样本混合后结合在样本中的CAR-T细胞上(具体为CAR分子的scFv结本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测CAR‑T细胞的捕获探针，其特征在于，所述捕获探针包括能够结合在CAR‑T细胞的配体，以及结合在该配体上的荧光分子。

【技术特征摘要】
1.用于检测CAR-T细胞的捕获探针，其特征在于，所述捕获
探针包括能够结合在CAR-T细胞的配体，以及结合在该配体上的荧
光分子。
2.根据权利要求1所述的捕获探针，其特征在于，所述配体包
括第一配体和第二配体；
所述第一配体能够结合在CAR分子scFv结构域上；且第一配
体还能结合有生物素；所述第二配体能够识别所述生物素，且所述
荧光分子能够结合在所述第二配体上。
3.根据权利要求2所述的捕获探针，其特征在于，所述第一配
体包括能够结合在IgG的lightchain或者heavychain上的蛋白；
和/或所述第二配体为能够结合生物素的蛋白或多肽，所述荧光
分子包括FITC、PE、PE-CYx、APC中的任一种。
4.根据权利要求3所述的捕获探针，其特征在于，所述第一配
体包括ProteinL、ProteinA、ProteinG以及该几种蛋白的变体；
和/或所述第二配体为链霉亲和素。
5.一种基于流式检测CAR-T细胞含量的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
将待检样本中加入结合有荧光分子的配体进行混合，使得配体
结合在待检样本中的CAR-T细胞上；然后离心并弃去上清，保留沉
淀物...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁薪安，何霆，马列，
申请(专利权)人：北京艺妙神州医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11