一种鹿茸多肽在降低间充质干细胞黏附力中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种鹿茸多肽在降低间充质干细胞黏附力中的应用，本发明专利技术中鹿茸多肽的氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM。该鹿茸多肽具有降低脂肪间充质干细胞(ADSCs)黏附性的作用，尤其是在浓度为50ug/ml时效果最为显著，能够在肿瘤、血栓、类风湿性关节炎治疗及降低机体免疫排异反应中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，涉及鹿茸多肽(VAPs)在降低间充质干细胞(ADSCs)黏附力中的应用。
技术介绍
鹿茸——归肝、肾经，补肾阳、益精血、强筋骨。属于传统中药之一。中华人民共和国药典(2005年版一部)将鹿茸功能与主治叙述为：壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。用于阳痿滑精，冷宫不孕，赢瘦，神疲，畏寒，眩晕耳鸣耳聋，腰膝冷痛，筋骨冷软，崩漏带下，阴疽不敛。鹿茸是隶属于脊索动物门哺乳纲鹿科的动物，它是梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化并且密生绒毛的幼角。鹿茸史载于《神农本草经》，指出:―鹿茸专入命门、督，兼入肝。甘咸气温，禀纯阳之质，含发生之气”，属中品。李时珍曰:―龟、鹿皆灵而有寿。鹿鼻常反向尾，能通督脉，故取其角，以补命、补精、补气，皆以养阳也。乃物理之玄微，神工之能事”。而且，现代药理研究亦表明，鹿茸有抗炎作用，可抑制和清除自由基，延缓衰老，促进创伤愈合等作用，鹿茸中提取的鹿茸多肽能够促进体外软骨细胞、成骨细胞的增殖和分化，抑制软骨细胞调亡，同时，文献研究也提示，以鹿茸等为代表的归肝、肾经药物在治疗“痹症”的方剂中使用频率占到39.3％。鹿茸中含有比较复杂的化学成分，氨基酸的种类有19种以上，其中包括人体自身不能合成的必需氨基酸，10种磷脂成分，9种脂肪酸(生物活性最强的油酸、亚油酸、亚麻酸含量较高)、糖脂、糖，固醇类、激素样物质、前列腺素、脑素、核糖核酸、去氧核糖核酸、三磷酸腺苷、硫酸软骨素、多胺、肽类、脂蛋白、维生素、酶类及各种微量元素等。本专利技术所用鹿茸多肽为利用离子交换层析、凝胶过滤层析及反相高效液相色谱层析等生物化学技术，从梅花鹿茸中分离得到的1个新多肽，SDS-PAGE电泳显示为一条带，HPLC图谱为单一峰，MALDI-TOFMS给出该多肽的精确分子量为3263.4，其等电点pI＝8.15.一级结构研究表明，该多肽是由32个氨基酸残基组成的直链多肽，不含半胱氨酸，富含缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甘氨酸。(张郑瑶等.\梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性.\高等学校化学学报33.9(2012):2000-2004.)。脂肪间充质干细胞是经过抽提脂肪组织并且经过分离培养所获得的一种纤维样细胞，是一种成体干细胞，与骨髓基质干细胞一样来自于中胚层，表面抗原与骨髓基质干细胞相似，且在在体外的培养条件、生长状态和表达标志物也与骨髓基质干细胞基本相同(ZukPA,ZhuM,AshjianP,etal.Humanadiposetissueisasourceofmultipotentstemcells[J].MolBiolCell,2002,13:4279一4295.)。具有来源广、丰富度高、损伤小、易于培养等优点。脂肪间充质干细胞具有多方面的作用，已经证明在治疗多种疾病方面具有巨大的潜力，可以诱导为神经元样细胞，治疗I型糖尿病、促进皮肤伤口愈合、减小急性及慢性肾损伤等。MarinaBurgos-Silva1等人的研究表明，脂肪间充质干细胞移植可以减少血清尿素，使肾衰竭小鼠的肾功能得到明显的改善(Burgos-SilvaM,Semedo-KurikiP,Donizetti-OliveiraC,CostaPB,CenedezeMA,HiyaneMI,etal.(2015)AdiposeTissue-DerivedStemCellsReduceAcuteandChronicKidneyDamageinMice.PLoSONE10(11):e0142183.doi:10.1371/journal.pone.0142183)，4周治疗后，可以减轻肾纤维化，减轻慢性炎症。脂肪间充质干细胞(ADSCs)在肾毒性损伤的治疗中起到积极的保护作用，可以通过调控细胞周期来抑制炎症，减轻肾脏损害，改进肾功能，抑制器官纤维化并长期提高免疫调节作用。通过在肾损伤的啮齿类动物中进行脂肪间充质干细胞治疗，证明可以用来减少组织炎症及肾损伤(MorigiM,IntronaM,ImbertiB,CornaD,AbbateM,RotaC,etal.(2008)Humanbonemarrowmesenchymalstemcellsacceleraterecoveryofacuterenalinjuryandprolongsurvivalinmice.StemCells26:2075–2082.doi:10.1634/stemcells.2007-0795PMID:18499895；FuruichiK,ShintaniH,SakaiY,OchiyaT,MatsushimaK,KanekoS,etal.(2012)Effectsofadiposederivedmesenchymalcellsonischemia-reperfusioninjuryinkidney.ClinExpNephrol16:679–689.doi:10.1007/s10157-012-0614-6PMID:22398959)。大量的实验已经证明，不同类型的干细胞在治疗肾损伤方面都具有明显的作用(FangTC,PangCY,ChiuSC,DingDC,TsaiRK(2012)Renoprotectiveeffectofhumanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcellsinimmunodeficientmicesufferingfromacutekidneyinjury.PLoSOne7：e46504.doi：10.1371/journal.pone.0046504PMID:23029541；FangTC,AlisonMR,CookHT,JefferyR,WrightNA,PoulsomR.(2005)Proliferationofbonemarrowderivedcellscontributestoregenerationafterfolicacid-inducedacutetubularinjury.JAmSocNephrol16:1723–1732.PMID:15814835)。而且，大多数的实验数据表明，干细胞治疗的主要机制是控制损伤发生过程中的炎症进程(StaggJ(2007)Immuneregulationbymesenchymalstemcells:twosidestothecoin.TissueAntigens69:1–9.PMID:17212702)。细胞黏附是指细胞与细胞之间以及细胞与胞外基质之间相互作用的黏附现象，也是细胞之间传递信息的一种形式(ParsonsJT,HorwitzAR,SchwartzMA.Celladhesion:integratingcytoskeletaldynamicsandcellulartension.NatRevMolCellBiol2010；11:633-43.)。细胞黏附在机体正常生理活动中发挥重要的作用。肿瘤的转移和复发是肿瘤致死的关键因素。在肿瘤细胞的转移中,有多种黏附分子参与癌细胞的脱落、黏附、迁移过程(ZiglerM,DobroffAS,Bar-EliM.Celladhesion:implicationintumorprogression.Minerva本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹿茸多肽在降低间充质干细胞黏附力中的应用，其特征在于，包括如下步骤：第一步，细胞培养；培养细胞为间充质干细胞，使用低糖型培养基，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养；第二步，细胞消化；取处于对数生长期的间充质干细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液；第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀；第四步，细胞计数；调节细胞个数为3.3×105个/ml；第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板，在37℃，5％CO2培养箱中培养；第六步，加入氨基酸序列VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM的鹿茸多肽；当间充质干细胞处于对数生长期时，吸出培养基，加入浓度为0～50ug/ml的鹿茸多肽，在37℃，5％CO2培养箱中培养12h；第七步：进行胰蛋白酶消化实验；留部分培养基，然后加入胰酶；每隔15s拍一张照片，观察不同时间，细胞形态的变化。

【技术特征摘要】
1.一种鹿茸多肽在降低间充质干细胞黏附力中的应用，其特征在于，包括如下步骤：第一步，细胞培养；培养细胞为间充质干细胞，使用低糖型培养基，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养；第二步，细胞消化；取处于对数生长期的间充质干细胞，进行常规消化，得到单细胞悬液；第三步，离心；将单细胞悬液放入离心管中进行离心；吸去上清液，加入培养基吹打细胞，使细胞分散均匀；第四步，细胞计数；调节细胞个数为3.3×105个/ml；第五步，种板；将分散均匀的细胞接种于孔板，在37℃，5％CO2培养箱中培养；第六步，加入氨基酸序列VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM的鹿茸多肽；当间充质干细胞处于对数生长期时，吸出培养基，加入浓度为0～50ug...

【专利技术属性】
技术研发人员：张郑瑶，王晓龙，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21