本发明专利技术公开一种人LOX-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法，涉及在大肠杆菌中高效可溶性表达人LOX-1细胞外结构域(hLOX-1ECD)的表达载体的构建、高效可溶性表达条件的确立及规模化大量纯化工艺的建立，可用于hLOX-1ECD的大量制备，本发明专利技术纯化过程简便易行，可实现大量制备，并且纯化的hLOX-1ECD蛋白纯度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开一种人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法，涉及在大肠杆菌中高效可溶性表达人L0X-1细胞外结构域(hLOX-1 E⑶)的表达载体的构建、高效可溶性表达条件的确立及规模化大量纯化工艺的建立，可用于hLOX-1 ECD的大量制备，属生物工程
技术介绍
心脑血管疾病的前身是动脉粥样硬化(Arteriosclerosis,以下简称As)。As是经多年无症状发展而突然致残致死的疾病，70% -80%的冠状动脉血栓的形成是继发于As 斑块的破裂。对人类而言，随年龄的增长动脉硬化几乎是不可避免的。As在形成脂纹这种初级阶段的时候是可逆的，经治疗，内腔狭窄和斑块可以回缩。所以As的早期诊断和及早针对性治疗对防治心脑血管疾病具有重要的现实意义。在As的发生机制研究中，人们发现氧化型低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein,以下简称οχ-LDL)是导致血管内皮细胞激活、损伤和功能失调的主要危险因子，在As的发病过程中起关键作用。植物血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-I (Lectin-like Oxidized Low Density Lipoprotein Receptor-1,以下简称 LOX-1)是介导血管内皮细胞对ox-LDL摄取的主要受体。从1997年Sawamura等在牛主动脉内皮细胞中发现了 οχ-LDL的受体L0X-1、次年 Yamanaka等发现人主动脉内皮细胞中同样存在L0X-1以来，研究者们围绕着L0X-1与As 间的关系进行了深入细致的研究。众多研究结果表明，L0X-1存在于As发生和发展的全过程中，是抗As药物筛选的新靶点和急性冠脉综合症的敏感而特异的生物标志物。然而， 以L0X-1为靶点的药物筛选和诊断试剂的研制工作，却由于无法获得大量可溶且稳定的 L0X-1蛋白而始终无法顺利进行。到目前为止所报道的L0X-1在大肠杆菌中的表达均是以包涵体形式存在的，包涵体复性是获得重组蛋白的主要方法。在众多的包涵体复性方法中，只有Machida等开发利用人工分子伴侣新材料对包涵体进行复性的方法[日本专利，公开号P2001-261697A]被商业化。Xie等利用该方法成功地获得了 L0X-1 C-末端凝集素样结构域(CTLD)的活性蛋白，Ohki等在此工作基础上得到其结晶体及X线的立体结构数据。然而包涵体复性因存在如下不足①反应条件苛刻，需要蛋白变性剂的参与；②过程复杂，费时且效率低；③回收率低，易造成大量损失；④复性后蛋白的稳定性差，在实际应用中受到制约。在大肠杆菌中可溶性表达L0X-1尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达及纯化方法，其目的是获得大量可溶且稳定的hL0X-l E⑶蛋白。本专利技术公开的人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，其技术解决方案包括以下步骤(I)表达载体的构建表达载体中使用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签；根据目的蛋白的二级结构及其 pi值的特性在目的蛋白N末端添加蛋白酶酶切位点；采用gateway连接技术构建表达质粒。(2)表达条件的优化使用大肠杆菌RoSetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞；通过培养条件及IPTG浓度变化控制表达速度。(3) hLOX-1 ECD 蛋白的纯化利用MBPTrap HP回收融合蛋白，通过蛋白酶酶切除去融合蛋白中的MBP标签，分子筛、 离子交换层析等交替使用得到在SDS-PAGE上为单一条带的高纯度hLOX-1 E⑶蛋白。实现上述方法的具体步骤如下1、表达载体的构建选择hLOX-1 ECD结构域为表达对象；利用PCR反应从人L0X-1 cDNA中扩增hLOX-1 E⑶基因片段；采用Gateway技术将目的基因同表达载体进行连接；1)以人L0X-1cDNA作为模板，设计引物引物 I :5’ -caccCTGGTGCCACGCGGTTCTTCCCAGGTGTCTGACCTCC-3’引物 2 :5，-tcattaCTGTGCTCTTAGGTTTGCCTTC-3，进行PCR反应，扩增出hLOX-1 E⑶基因片段；2)构建重组克隆质粒pENTR-thr-hLOX-1ECD，将其转化到ToplO感受态细胞中，分离含有pEhLOX-lE质粒的大肠杆菌并培养扩增，回收pEhLOX-lE质粒；3)向带有MBP融合标签的表达载体pDEST-Mal中插入hLOX-1E⑶基因片段；质粒pEhLOX-lE和pDEST-Mal连接，将反应产物转入大肠杆菌DH5 α，用含有氨苄青霉素的平板筛选含有表达载体pDEST-Mal-thr-hLOX-1 E⑶的大肠杆菌，并进行扩大培养、提取 pDMhLOX-ΙΕ质粒、测序验证插入的hLOX-1 E⑶基因序列的正确性；2、表达条件的优化1)用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞，将质粒pDMhLOX-ΙΕ通过化学转化法转入宿主细胞中，保存含有质粒pDMhLOX-ΙΕ的大肠杆菌备用；2)高效表达条件的建立①初始培养温度为30-37度；②诱导培养温度为20-35度；③IPTG浓度为100-500微摩尔之间；④开始诱导时的菌体浓度(以0D_时的吸光度为浓度计算参数)OD6tltl= 0.4-0. 6。、hL0X-l ECD 蛋白的纯化将菌体悬浮在生理缓冲液中，采用超声法破碎细胞；将细胞碎片等沉淀物质除去，回收上清液进入分离纯化工序⑴使用MBPtrap HP亲和层析柱回收可溶的融合蛋白，操作规程依据MBPtrap HP的使用说明书所记述的操作规程。缓冲液为上述的缓冲液A和B，回收含有融合蛋白的组分。(2)将融合蛋白通过制备型分子筛进行纯化，收集目的蛋白峰。使用缓冲液C进行洗脱，设定洗脱流速为1.5 ml/min。(3)用凝血酶切开标签蛋白MBP同hLOX-1 ECD蛋白的连接，用MBPtrap HP柱除去 MBP蛋白，回收含有hLOX-1 E⑶蛋白的组分。(4)采用阴离子和阳离子交换树脂连续交替处理，进一步纯化hLOX-1 E⑶蛋白。使用缓冲液D和E，设定梯度洗脱流速为I. 5 ml/min。回收纯化后的hLOX-1 E⑶蛋白。(5)进一步分子筛纯化，得到高纯度活性hLOX-1 E⑶蛋白。本专利技术公开的人L0X-1构成如图I所示L0X-1由四个结构域构成N-末端胞浆结构域、跨膜结构域(TM)、颈环结构域(NECK)、C-末端凝集素样结构域(CTLD) ；NECK和CTLD构成人L0X-1细胞外结构域(hLOX-1 ECD)，是关键功能结构域。在CTLD结构域中存在三个二硫键。本专利技术中hLOX-1 E⑶在大肠杆菌中形成包涵体的原因归纳为以下几点(1)合成蛋白的速度过快、浓度过高，没有足够的时间和空间形成正常结构；(2)蛋白在折叠过程中疏水区暴露于溶液中，由于分子间的相互作用而形成错误折叠导致凝集；(3)细胞内部表达环境的还原性过高，使蛋白质中二硫键稳定性下降，出现错配或多余的~■硫键；(4)培养温度、pH值、某些金属离子等因素影响重组蛋白动力学的稳定。利用本专利技术获得的hLOX-1 ECD蛋白可作为试剂、抗原、靶标分子等应用于科研或 /和以临床医疗为目的的相关药物等的开发与研究。本专利技术的积极本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，包括以下步骤(1)表达载体的构建表达载体中使用麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签；根据目的蛋白的二级结构及其 pi值的特性在目的蛋白N末端添加蛋白酶酶切位点；采用gateway连接技术构建表达质粒;(2)表达条件的优化使用大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)作为表达宿主细胞；通过培养条件及IPTG浓度变化控制表达速度；(3)hL0X-lECD蛋白的纯化利用MBPTrap HP回收融合蛋白，通过蛋白酶酶切除去融合蛋白中的MBP标签，分子筛、 离子交换层析等交替使用得到在SDS-PAGE上为单一条带的高纯度hLOX-1 E⑶蛋白。2.—种人L0X-1细胞外结构域的高效可溶性表达方法，包括以下步骤表达载体的构建选择hLOX-1 ECD结构域为表达对象；利用PCR反应从人L0X-1 cDNA中扩增hL0X_l E⑶基因片段；采用Gateway技术将目的基因同表达载体进行连接；1)以人L0X-1cDNA作为模板，设计引物引物 I :5’ -caccCTGGTGCCACGCGGTTCTTCCCAGGTGTCTGACCTCC-3’引物 2 :5，-tcattaCTGTGCTCTTAGGTTTGCCTTC-3，进行PCR反应，扩增出hLOX-1 E⑶基因片段；2)构建重组克隆质粒pENTR-thr-hLOX-1ECD，将其转化到ToplO感受态细胞中，分离含有pEhLOX-lE质粒的大肠杆菌并培养扩增，回收pEhLOX-lE质粒；3)向带有MBP融合标签的表达载体pDEST-Mal中插入hLOX-1E⑶基因片段；质粒pEhLOX-lE和pDEST-Mal连接...
【专利技术属性】
技术研发人员：相宏宇，谢秋宏，孟兆丽，张海辉，张欣冉，谢彦博，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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