一种人脐带间充质干细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及干细胞领域，公开了一种脐带间充质干细胞的培养方法。本发明专利技术所述脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，剪碎后加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。本发明专利技术所述培养方法操作简单、安全有效。实验表明，与现有方法相比，本发明专利技术所述脐带间充质干细胞的培养方法原代时间短，增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，培养至P15代后仍然保持良好的增殖能力，且能很好保持脐带间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性，适用于脐带间充质干细胞的大量培养。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞领域，具体涉及。
技术介绍
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期的中胚层和外 胚层，具有自我更新、多向分化、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性的细胞，产 生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生医学领域有重要 作用。 目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连 续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾 病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。脐带间充质干细胞（UCMSCs)是 存在于脐带华尔通胶（Wharton'sjelly)和血管周围组织中的一种干细胞。来源于脐带的 间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异 体排斥反应，成本低，对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，使其成为未来干细胞在医 疗应用上具有巨大潜力的理想选择。 目前脐带间充质肝细胞的原代分离的方法主要有酶解法及组织块培养法。酶解法 中使用到的胶原酶等来源可能涉及动物来源，且价格昂贵，对细胞损伤较大。而组织块培养 法细胞爬出的时间较长，原代培养时间过长使得细胞容易长老，细胞纯度不够，容易受到脐 带中其他细胞的污染。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种脐带间充质干细 胞的培养方法，本专利技术所述培养方法原代培养时间短、简单经济，可获得大量高纯度脐带间 充质干细胞，且能保持脐带间充质干细胞良好的干细胞特性。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案： -种脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，剪碎后 加入完全培养基，于37°C，5% 0)2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后 去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。 本专利技术脐带间充质干细胞的培养方法，所述脐带可以取自产后弃置的脐带组织， 采用含有双抗的PBS保存。所述含有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其 中青霉素工作浓度为l〇〇U/mL，链霉素工作浓度为0. lmg/mL。 本专利技术脐带间充质干细胞的培养方法中所述脐带预先清洗表面血迹并消毒。在 一些实施方案中，所述脐带用50mL~150mL无菌的PBS清洗脐带表面血迹，用50mL~ 150mL75%乙醇消毒脐带表面，再用50mL~150mL PBS清洗数遍尽量去除血迹。 本专利技术脐带间充质干细胞的培养方法，脐带去除最外层膜及静脉跟动脉后剪碎以 充分与培养基接触。在一些实施方案中，脐带去除最外层膜及静脉跟动脉后剪至大小为 1mm3~3mm 3的小块，以0. 5cm~lcm的间隔把组织块分布于培养皿中。 在一些实施方案中，所述培养方法将将间隔放置的组织块静止风干20min~ 60min〇 本专利技术脐带间充质干细胞的培养方法，将剪碎的组织块加入完全培养基培养进行 原代细胞分离。其中，所述完全培养基配方为lonzaUltraCULTURE MEDIUM无血清培养基 +10v/v% PALL 血清替代物 +lv/v% 200mM/L_ 谷氨酰胺 +1 XNF.AA.5ng/mT,~50ng/mL EGF。 在一些实施方案中，所述培养前完全培养基的加入量为0. 07mL/cm2-0. lmL/cm2。 本专利技术脐带间充质干细胞的培养方法，在培养期间需要补加完全培养基直至组 织块有细胞爬出。在一些实施方案中，所述培养期间补加完全培养基的加入量为〇. 〇7mL/ cm2-〇. lmL/cm2。 本专利技术脐带间充质干细胞的培养方法，在组织块有细胞爬出后去掉组织块，并对 细胞进行清洗。所述清洗可以采用PBS清洗。 本专利技术脐带间充质干细胞的培养方法，在清洗后加入完全培养基培养细胞至 集落成片进行传代。在一些实施方案中，所述清洗后完全培养基的加入量为〇.15mL/ cm 2-〇. 21 ml,/cm2。 在一些实施方案中，所述传代培养为去掉细胞培养上清，清洗后加入含胰酶和 EDTA的消化液消化，用完全培养基终止消化，离心，弃上清，用完全培养基重悬后，传代。 在一些实施方案中，所述传代培养中含胰酶和EDTA的消化液的加入量为 0. 015mL/cm2_0. 04mL/cm2。在一些实施方案中，所述传代培养中含胰酶和EDTA的消化液中胰酶浓度为 0? 05%~0? 3%〇 在一些实施方案中，所述传代培养中含胰酶和EDTA的消化液中EDTA浓度为 0. 01%~0. 04%。 在一些实施方案中，所述传代培养中消化液消化的时间为l-3min。 在一些实施方案中，所述终止消化的完全培养基的加入量为消化液体积的5倍~ 10倍。 在一些实施方案中，所述传代培养中所述离心为200g_400g离心5min。 在一些实施方案中，所述传代密度为8000个细胞/cm2-15000个细胞/cm2。 在一个具体实施例中，用不去除脐带外膜的组织块培养法作为对比例，比较本发 明所述脐带间充质干细胞的培养方法原代培养时间及原代传代时获得的细胞总数，结果显 示本专利技术所述脐带间充质干细胞的培养方法原代培养时间明显短于不去除脐带外膜的组 织块培养法，传代前获得的脐带间充质干细胞也更多。 在一个具体实施例中，用不去除脐带外膜的组织块培养法作为对比例，比较本发 明所述脐带间充质干细胞的培养方法传代至15代细胞形态，结果显示本专利技术所述脐带间 充质干细胞的培养方法培养的脐带间充质干细胞一直传至P15代仍然保持良好的增殖能 力，两到三天即可融合至80 %，而不去除脐带外膜的组织块培养法在P6代开始，增殖速度 明显降缓，细胞变大，老化。。 在一个具体实施例中，本专利技术采用CCK-8法检测本专利技术所述脐带间充质干细胞的 培养方法培养的脐带间充质干细胞的增殖能力，结果显示，本专利技术所述脐带间充质干细胞 的培养方法培养的脐带间充质干细胞在P1-P10代均保持旺盛的增殖能力，增殖曲线变化 不明显，而不去除脐带外膜的组织块培养法在P10代即表现出明显的增殖减缓现象。进一步的，在一个具体实施例中，本专利技术采用流式细胞仪分析本专利技术所述脐带间 充质干细胞的培养方法培养的脐带间充质干细胞细胞的表面标志物CD45、CD59、CD90、 HLA-DR等的表达情况，结果显示本专利技术所述脐带间充质干细胞的培养方法培养的细胞可获 得较多的脐带间充质干细胞，细胞纯度更高，在持续培养至P15代，细胞表面标记没有明显 变化。由此可见，采用本专利技术所述脐带间充质干细胞的培养方法培养的脐带间充质干细 胞能够很好保持干细胞的形态及良好的干细胞特性。 本专利技术所述脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉， 剪碎后加入完全培养基，于37°C，5% C02静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞 爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。本专利技术所 述培养方法操作简单、安全有效。实验表明，与现有方法相比，本专利技术所述脐带间充质干细 胞的培养方法原代时间短，增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，培养至P15代后 仍然保持良好的增殖能力，且能很好保持脐带间充质干细胞的形态和良好的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脐带间充质干细胞的培养方法，取脐带去除最外层膜及静脉跟动脉，剪碎后加入完全培养基，于37℃，5％CO2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基，待细胞集落成片生长后，传代培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，麦锦连，马岩岩，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44