永生化人脐带间充质干细胞系及其建立方法和应用技术

本发明专利技术获得了永生化人脐带间充质干细胞系。通过构建重组慢病毒plvx-htert载体，将人端粒酶的催化亚基hTERT导入到脐带间充质干细胞中，筛选出了能够稳定表达出hTERT的干细胞系。经过细胞培养及各种水平的鉴定，证明所获得的是一种永生化的脐带间充质干细胞系，该细胞系保持分化能力。本发明专利技术还用多种方法证实了该细胞系的生物活性、功能，证明其可作为基因治疗的有效的载体。本发明专利技术还通过小鼠致瘤实验表明该细胞系的安全性，没有致瘤倾向。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种永生化人脐带间充质干细胞，具体涉及一种能够稳定表达出人端粒酶催化亚基hTERT的干细胞系。本专利技术还涉及该干细胞系的建立方法和应用。本专利技术还涉及一种含有人端粒酶催化亚基基因htert的重组慢病毒载体的构建。
技术介绍
：人间充质干细胞（Human Mesenchymal Stem Cells,以下简称为hMSCs）是可应用于再生医学方面及作为基因治疗的靶向细胞，在细胞替代与基因治疗方面具有广泛临床应用前景。但hMSCs许多方面存在有待解决的问题，尤其是自体hMSCs在移植应用中数量不足，限制了临床应用。解决这一问题的主要途径应包括两个方面：一是增强hMSCs的增殖活力，二是应用异体或异种hMSCs。但异体移植有免疫学问题，因此，永生化的人间充质干细胞的建立是非常有意义的工作。端粒是染色体末端串连、重复的TTAGGG序列，在正常细胞分裂过程中会逐渐变短。当端粒在一个或多个染色体中缩短到某一极限值时，细胞衰老和生长停止就会发生。端粒的长度是由端粒酶维持的。端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶催化亚基，实验表明，外源性htert基因导入细胞可提高端粒酶活性，延缓细胞的衰老，保持了多向分化潜能并没有致瘤倾向。这说明用htert基因转染修饰hMSCs可以达到延长hMSCs生命周期、保持多向分化潜能的目的。Simonsen J.L等通过逆转录病毒载体将hTERT转入人骨髓间充质干细胞hMSCs，筛<br>选到的骨髓hMSCs细胞克隆在体外培养到200代，细胞无衰老迹象、并保持了多向分化潜能。本研究通过构建重组慢病毒载体plvx-htert，慢病毒载体感染效率高，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在细胞内长时间的表达且安全性高。将人端粒酶的催化亚基hTERT导入到脐带间充质干细胞中，使细胞能够长期传代，建立起永生化的人脐带间充质干细胞系尚未见报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的是，筛选出永生化的人脐带间充质干细胞，以解决干细胞取材难及细胞分裂有限的问题，为基础研究及基因治疗提供充足的细胞来源。本专利技术通过构建重组慢病毒载体plvx-htert，将人端粒酶的催化亚基基因htert导入到脐带间充质干细胞中，筛选出了能够稳定表达出hTERT的干细胞系，经过细胞培养及各种水平的鉴定，证明已经获得了永生化的脐带间充质干细胞系，该细胞系保持分化能力，没有致瘤倾向，可以作为表达各种抗原与抗体的基因载体。本专利技术具体进行了以下研究：1、构建了含有人端粒酶催化亚基基因htert的重组慢病毒载体plvx-htert。与骨架质粒共转染293T细胞，成功地包装出含有htert的重组慢病毒，并测定了重组慢病毒的滴度。2、筛选出阳性的hMSC-hTERT细胞系用含有htert重组慢病毒载体感染分离到的第二代人脐带hMSCs，在嘌呤霉素的筛选下，成功地筛选出阳性的hMSC-hTERT，并继续培养，已成功地将hMSC-hTERT细胞培养到105代细胞。将此细胞系进行了生物材料保藏，保藏编号为CGMCC No.6609。3、用多种方法证明了上述所得hMSC-hTERT细胞系的生物活性、功能1）用实时定量PCR及常规PCR技术在DNA、RNA及水平检测了htert基因的表达水平明显增加；2）用端粒酶活性试剂盒（Trapeze telomerase detection kit）和银染的方法鉴定hMSC-hTERT细胞系具有端粒酶的活性；3）细胞流式分析表明该细胞系表面标记均符合hMSCs特征；4）用成骨试剂诱导hMSC-hTERT细胞系，碱性磷酸酶水平升高，证明能够诱导出成骨细胞，表明hMSC-hTERT仍然具有多向分化能力；5）核型分析表明hMSC-hTERT具有正常的二倍体特征；6）可作为基因治疗的有效的载体将用于治疗EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的包含潜伏膜蛋白2（LMP2）基因的重组腺病毒感染hMSC-hTERT，免疫酶方法检测结果表明，hMSC-hTERT细胞系表达出LMP2蛋白。用含有2G12抗HIV中和抗体的重组慢病毒去感染该细胞系，用ELISA方法鉴定出细胞上清中能够表达出中和抗体2G12，浓度可以达到5μg/ml。因此，建立的hMSC-hTERT可以高效的表达外源基因，可作为基因治疗的有效的载体。4、证实了该细胞系的安全性小鼠致瘤实验表明，建立的hMSC-hTERT细胞系在小鼠体内没有致瘤现象，证实该细胞系没有致瘤性，比较安全。本专利技术解决了细胞取材难及细胞分裂有限的问题，为基础研究及基因治疗提供充足的hMSCs细胞来源。永生化的脐带hMSCs干细胞可应用于再生医学方面及作为基因治疗的靶向细胞。本专利技术的优点：首先，本专利技术使用慢病毒载体将人端粒酶催化亚基导入到人脐带hMSCs中，慢病毒效率比较高，并且能够感染非分裂时期的细胞。第二，成功地筛选到了hTERT阳性的细胞系hMSCs-hTERT，在体外培养已达到105代，远远地超过了脐带间充质干细胞的体外增殖能力，证明成功地获得永生化的人脐带间充质干细胞系。第三，筛选到的细胞系细胞形态及细胞表面抗原均符合人脐带间充质干细胞特征，核型分析表明该细胞仍然是二倍体细胞，保持分化潜能，并且没有致瘤倾向。附图说明：图1中，A为构建的重组慢病毒载体plvx-htert图谱；B为重组慢病毒载体plvx-htert瞬时转染293T细胞后，hTERT表达的免疫荧光结果图，图中白色亮点为hTERT阳性表达细胞，暗色为阴性表达细胞图2中，A为在RNA水平式上测定htert基因的RealTime-PCR结果，18s为内参；B为DNA水平上PCR结果图，所用两对引物均跨内含子，1、2为hMSCs-hTERT细胞系、3为hMSCs、4为阴性对照。图3为用TRAP-ELISA银染方法检测细胞中端粒酶活性图，图中PC为阳性对照，C为阴性对照，hMSCs对照，能够稳定表达出绿色荧光蛋白的hMSC-gfp细胞系及hMSC-hTERT图4是建立的人脐带间充质干细胞系hMSC-hTERT不同代数可见光图片，分别是19、39、67和89代hMSC-hTERT细胞系图5为建立的人脐带间充质干细胞系的诱导分化成骨情况图，A图为未诱导hMSC-hTERT；B图为诱导成骨的hMSC-hTERT，经碱性磷酸酶染色结果，深色部分为碱性磷酸酶染色图像。图6是hMSCs-hTERT小鼠致瘤实验结果图，左边组为Hela细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
保藏编号为CGMCC？No.6609的人脐带间充质干细胞系hMSC？hTERT。

【技术特征摘要】
1.保藏编号为CGMCC No.6609的人脐带间充质干细胞系hMSC-hTERT。
2.一种可稳定表达出人端粒酶的催化亚基hTERT的细胞系，其特征是人脐带间充质
干细胞中导入了人端粒酶的催化亚基hTERT。
3.含有人端粒酶催化亚基基因htert的重组慢病毒载体。
4.权利要求3所述载体的构建方法，其特征是...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾毅，郝彦哲，滕智平，马晶，张晓梅，李东升，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京工业大学，曾毅，郝彦哲，滕智平，
类型：发明
国别省市：