一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞的制备方法，其包括如下步骤：构建携带金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS-hMT；制备携带人金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒rAAV-hMT，测定滴度；将重组腺相关病毒rAAV-hMT感染脐带间充质干细胞，得到携带人金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞。本发明专利技术得到的携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞用于衰老模型小鼠，能有效延缓小鼠衰老进程；将其用于高血铅模型小鼠，可明显降低小鼠血铅含量。

【技术实现步骤摘要】
一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞及其应用
本专利技术属于干细胞再生医学
更具体地，本专利技术涉及一种携带人金属硫蛋白（HumanMetallothionein，hMT）基因的脐带间充质干细胞的制备方法，及其在氧自由基、重金属导致疾病或衰老治疗中的应用。
技术介绍
金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是指一类低分子量、高巯基含量（20%-30%），能大量结合金属离子的性能独特的蛋白质或活性肽。在人体、动物、植物以及微生物体内均广泛存在。MT具有非常保守的一级结构和相似的空间结构，在许多物种中MT以多种亚型存在。MT具有较强的清除自由基的作用。自由基过剩或任何引起自由基过程剩的因素均会引起细胞病变，影响细胞正常功能的发挥，甚者引起衰老及疾病。天然形式下MT中的巯基均以还原状态存在，巯基具亲核性，从而使MT易与亲电性物质特别是某些自由基相互作用。MT对自由基如羟自由基(OH)，氧自由基(O2)或一氧化氮(NO)等有较强的清除作用。MT是讫今为止发现的清除自由基最强的活性蛋白蛋（或多肽），其清除羟自由基（OH）的能力约为SOD的10,000倍，而清除氧自由基（O）的能力约是谷胱甘肽（GSH）的25倍。MT富含巯基及其重金属结合能力决定了它在重金属解毒方面起着重要的作用。MT的巯基基团（-SH）能强烈螯合有毒重金属Hg、Pb、Cd、As等，其中螯合Pb的强度比Zn大200倍，而螯合Cd的强度又比Pb大10倍[13]，从而使它们无法毒害人体，同时对体内Zn等微量元素无影响。这对保护大脑、肝、肾等人体重要器官具有极其重要意义。目前，MT的来源主要有三类，一类是在培养基中添加金属离子，直接诱导微生物生产MT；另一类是对动物喂养含金属离子的饲料或者注射相关溶液，然后从动物内脏中提取MT；还有的就是利用基因工程技术生产MT。这几类生产方法都存在着产量极低，成本高、提纯步骤复杂的缺陷，更值得一提的是直接诱导法、动物提取法产生的MT为非人源性MT，且常结合有重金属，失去了清除氧自由基和结合重金属的能力。因此，针对MT的转基因治疗将逐渐成为研究的热点方向。脐带间充质干细胞（umbilical-derivedmesenchymalstemcells，UMSCs）是存在于脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种干细胞，具有多向分化和自我更新的潜能。UMSCs具有以下优点：脐带是分娩后的废弃物，取材方便；UMSCs可在体外分离、培养，扩增迅速，且生物学特性稳定；UMSCs免疫原性低，异体移植不引起免疫排斥反应；UMSCs具有分泌SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、SDF-1、VEGF等因子的特性，具有免疫调节功能，可用于自身免疫性疾病、神经系统疾病的治疗。当前，针对MSC抗衰老、MSC基因修饰等研究才刚刚兴起，国内外尚无携带hMT基因UMSCs构建的报道，亦无其用于氧自由基、重金属导致的疾病治疗、抗衰老的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有较强实用价值的携带人金属硫蛋白（HumanMetallothionein，hMT）基因的脐带间充质干细胞方法。得到的携带hMT基因的脐带间充质干细胞具有分泌hMT、SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL-6等因子，去除氧自由基或重金属，调节体内微环境的特性。将其用于衰老模型小鼠，能有效延缓小鼠衰老进程；将其用于高血铅小鼠，可明显降低血铅含量。本专利技术的携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞制备方法，包含如下步骤：（1）将人金属硫蛋白基因连接到腺相关病毒载体pAAV-MCS上，得到携带人金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT，鉴定人金属硫蛋白基因已连接到腺相关病毒载体上；（2）利用磷酸钙共沉淀法将重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT、pHelper和pAAV-RC共转染到AAV-293细胞中，培养直至AAV-293细胞出现表型变化和毒性反应；（3）收集细胞悬液，反复冻融后，收集含有重组腺相关病毒株rAAV-hMT的上清液，纯化并测定毒株的滴度；（4）将重组腺相关病毒rAAV-hMT按20MOI加入第2代对数生长期脐带间充质干细胞培养液中，培养箱培养，得到携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞。步骤（1）所述的人金属硫蛋白基因经RcoRI和XbaI双酶切后插入pAAV-MCS，构建重组质粒pAAV-MCS-hMT；合成鉴定引物5’-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3’，5’-CAGCTGCACTTGTCTGACGT-3’；测序鉴定hMT基因正确连接到pAAV-MCS质粒上；步骤（2）培养AAV-293细胞，待细胞生长密度为80%，制备1mg/mL浓度的pAAV-MCS-hMT、pAAV-RC、pHelper，共转染AAV-293细胞进行重组病毒包装。于37℃、5%CO2条件下转染孵育6h后，更换培养液，继续培养直至AAV-293细胞出现表型变化和毒性反应，完成病毒包装；步骤（3）收集细胞悬液轮流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰冻和37℃水浴箱中融化，反复冻融4次，每次10分钟，室温下10000g转速离心10分钟，收集含有重组腺相关病毒株rAAV-hMT的上清液，纯化并测定毒株的滴度；步骤（4）将重组腺相关病毒rAAV-hMT按20MOI加入第2代对数生长期脐带间充质干细胞培养液中，5%CO2，37℃细胞培养箱培养24小时，得到携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞。采用上述技术方案，本专利技术方法可获得一种携带有人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞，以2×105/ml细胞浓度结种至细胞培养瓶，置于5%CO2，37℃细胞培养箱培养24小时，培养液中人金属硫蛋白含量明显升高。该携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞或分泌液可用来制备成用于氧自由基、重金属导致疾病或衰老治疗的制品。附图说明图1．重组腺相关病毒rAAV-hMT的构建示意图；图2．MTS法测定20MOI腺相关病毒rAAV-hMT感染UMSCs细胞存活率结果图；图3．流式细胞术测定携带人金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞表面标记结果图；图4．携带人金属硫蛋白基因UMSCs的成骨、成脂分化结果图图5．qRT-PCR法检测携带人金属硫蛋白UMSCshMTmRAN水平结果图；图6．携带人金属硫蛋白基因UMSCs对重金属Cd2+、Pb2+耐受性鉴定结果图；图7．携带人金属硫蛋白基因UMSCs对衰老小鼠血清MT、脑组织端粒酶影响结果图；图8．携带人金属硫蛋白基因UMSCs对高铅小鼠的促排铅作用结果图。具体实施方式以下结合附图详细说明本专利技术的具体实施方式：实施例一携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞的制备本专利技术将两端含有RcoRI和XbaI酶切位点的hMT基因片段和pAAV-MCS质粒用RcoRI和XbaI双酶切，用T4连接酶将hMT基因连接到pAAV-MCS质粒上，构建重组质粒pAAV-MCS-hMT；合成鉴定引物5’-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3’，5’-CAGCTGCACTTGTCTGACGT-3’；进行测序鉴定hMT基因正确连接到pAAV-MCS质粒上（见图1）。将1mg/mL浓度的pAAV-MCS-hMT、pAAV-RC、pHelp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将金属硫蛋白基因连接到腺相关病毒载体pAAV‑MCS上，得到携带金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体pAAV‑MCS‑hMT，鉴定金属硫蛋白基因已连接到腺相关病毒载体上；（2）利用磷酸钙共沉淀法将重组腺相关病毒载体pAAV‑ MCS‑hMT、包装质粒、辅助质粒共转染到AAV‑293细胞中，培养至AAV‑293细胞出现表型变化和毒性反应；（3）收集细胞悬液，采用反复冻融方法，收集含有重组腺相关病毒株rAAV‑hMT的上清液，纯化并测定rAAV‑hMT毒株的滴度；（4）重组腺相关病毒rAAV‑hMT感染脐带间充质干细胞，得到携带有金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将人金属硫蛋白基因连接到腺相关病毒载体pAAV-MCS上，得到携带金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT，鉴定金属硫蛋白基因已连接到腺相关病毒载体上；(2)利用磷酸钙共沉淀法将重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT、包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper共转染到AAV-293细胞中，培养至AAV-293细胞出现表型变化和毒性反应,完成重组腺相关病毒株rAAV-hMT的包装；(3)收集细胞悬液，采用反复冻融方法，收集含有重组腺相关病毒株rAAV-hMT的上清液，纯化并测定rAAV-hMT毒株的滴度；(4)重组腺相关病毒rAAV-hMT感染脐带间充质干细胞，得到携带有金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞；所述人金...

【专利技术属性】
技术研发人员：湛敏，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：丁长才，湛敏，
类型：发明
国别省市：广东;44