一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用转基因法诱导分化人脐带间充质干细胞获得胰岛β细胞的方法，使用包含PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21胰岛细胞特异基因并连接穿膜信号的腺病毒表达载体，结合多种重组蛋白和小分子，诱导人脐带间充质干细胞定向分化为有功能的胰岛β细胞。本发明专利技术的诱导方法简便、易操作、分化效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种诱导形成胰岛β细胞的方法，尤其是涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法。
技术介绍
糖尿病是由于胰岛β细胞破坏或胰岛素抵抗所致的胰岛素绝对或相对缺乏。糖尿病治疗目前仍然是治标不治本，药物治疗虽然能有效降低血糖，但不能有效修复胰岛功能。补充胰岛素是1型和部分2型糖尿病的传统治疗方法。但是胰岛素治疗虽能控制症状、延缓和减少并发症的发生，却不能使糖尿病彻底治愈，且长期使用胰岛素会产生诸如失明、肾衰、肥胖等严重的并发症以及产生胰岛素抵抗，另外每天注射胰岛素本身也给患者带来极大的痛苦，给患者、家庭和社会带来沉重的经济负担。胰岛细胞移植虽然是一个有效的治疗策略，然而面临的问题依然是供体缺乏及免疫排斥等医学与伦理学问题。再生医学在器官修复与替代方面起重要的作用，也为糖尿病的治疗提供了新思路。间充质干细胞（MesenchymalStemCells，MSCs）起源于中胚层，在骨髓、脐带、脐血、脂肪等多种组织和器官中均可分离获得，具备干细胞的自我扩增和多向分化性，在发育的不同阶段和特定环境条件下，能分化为多种间质起源的组织细胞，如成骨、软骨和脂肪细胞，也能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。MSCs兼具再生、修复和免疫调节等多方面的作用。而人脐带来源的间充质干细胞（Umbilical-DerivedMesenchymalStemCells，UMSCs）是存在于脐带沃顿胶和血管周围组织中的间充质干细胞。与来源于骨髓的间充质干细胞相比，具有更加显著的优势，包括：采集方便为无创性操作；来源于胎儿脐带的间充质干细胞比成人骨髓间充质干细胞更幼稚，增殖和分化潜能更大；脐带来源丰富，可以进行规模化生产，使其在临床应用尤其是治疗糖尿病方面展现出更广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种方法简便、易操作、效果好的体外诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法。本专利技术解决其技术问题的解决方案是：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：1）将人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中培养，得到贴壁生长的人脐带间充质干细胞；2）用PBS清洗步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞，然后用胰酶消化收集；3）将收集到的人脐带间充质干细胞用无血清的DMEM/F12培养基培养，同时添加六种腺病毒进行腺病毒感染，感染24小时后，用PBS清洗细胞，然后添加含有胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，培养三天后，PBS清洗，再次进行腺病毒感染，如此循环，共进行三次腺病毒感染，完成人脐带间充质干细胞向胰岛β细胞的诱导分化；所述六种腺病毒的转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21。所述DMEM高糖培养基添加有胎牛血清FBS，碱性成纤维生长因子bFGF。优选地，所述胎牛血清FBS的添加比例为10~20wt%，所述碱性成纤维生长因子bFGF的添加浓度为10~100ng/mL。所述人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中培养3天。所述人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中的培养密度为5×103个细胞/cm2用PBS清洗得到的人脐带间充质干细胞3次，然后用0.25%质量体积比的胰酶消化收集。所述六种腺病毒，每种腺病毒加入的MOI（感染复数）为30，六种腺病毒的总MOI为180。所述六种腺病毒的滴度分别为PDX1：2.96×108pfu/mL，MAFA：8.52×109pfu/mL，NGN3:5.24×109pfu/mL，FOXA2：4.35×109pfu/mL，NEUROD1：3.62×108pfu/mL和FGF21：4.15×108pfu/mL。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用转基因法诱导人脐带间充质干细胞分化，获得胰岛β细胞；具体地，使用包含PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21胰岛细胞特异基因并连接穿膜信号的腺病毒表达载体，结合多种重组蛋白和小分子，诱导人脐带间充质干细胞定向分化为有功能的胰岛β细胞。本专利技术的方法简便、易操作、分化效果好。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。图1是本专利技术的人脐带间充质干细胞形貌图；图2~图7人脐带间充质干细胞在向胰岛β细胞分化的过程中形态变化；图8本专利技术的实施例1诱导得到的胰岛β细胞双硫腙DTZ染色法鉴定结果；图9本专利技术的实施例1诱导得到的胰岛β细胞胰岛功能检测结果。具体实施方式以下将结合实施例和附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本专利技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本专利技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本专利技术保护的范围。本专利技术创造中的各个技术特征，在不互相矛盾冲突的前提下可以交互组合。本专利技术的一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，具体地步骤是：1、人脐带间充质干细胞的提取。使用经产妇同意授权的新生儿脐带作为间充质干细胞的来源。新鲜获取的脐带，75%乙醇中表面消毒，在超净工作台中操作，生理盐水清洗后分离剥除脐带血管，获得华通氏胶部分。将获得的华通氏胶冲洗后剪碎，稀释后种瓶，在二氧化碳培养箱中培养。通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，待细胞融合度达到70-80%后传代培养，收获的人脐带间充质干细胞冷冻存储待用。人脐带间充质干细胞的提取并不限于上述方法，还可以通过其他的本领域技术人员熟悉的方法。显微镜下观察细胞生长情况，可以看到细胞贴壁生长，呈长梭形，包浆透亮，胞体较小，有立体感。如图1所示。2、六种含转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21的腺病毒准备。腺病毒为外包制备，-80℃保存，优选地，腺病毒滴度分别为：PDX1：2.96×108pfu/mL，MAFA：8.52×109pfu/mL，NGN3：5.24×109pfu/mL，FOXA2：4.35×109pfu/mL，NEUROD1：3.62×108pfu/mL和FGF21：4.15×108pfu/mL。3、人脐带间充质干细胞的诱导分化。3.1将冷冻存储的人脐带间充质干细胞复苏，洗涤一次后以适宜密度于细胞培养皿中培养，培养基成分为DMEM高糖培养基，得到贴壁生长的人脐带间充质干细胞；优选地，所述高糖培养基中按一定比例添加胎牛血清FBS，碱性成纤维生长因子bFGF，进一步地，所述胎牛血清FBS的添加比例为10~20wt%，所述碱性成纤维生长因子bFGF的添加浓度为10~100ng/mL。优选地，所述培养时间为3天。3.2用PBS清洗得到步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞；优选地，清洗三次，然后用0.25%质量体积比的胰酶消化收集。3.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中培养，得到贴壁生长的人脐带间充质干细胞；2）用PBS清洗步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞，然后用胰酶消化收集；3）将收集到的人脐带间充质干细胞用无血清的DMEM/F12培养基培养，同时添加六种腺病毒进行腺病毒感染，感染24小时后，用PBS清洗细胞，然后添加含有胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，培养三天后，PBS清洗，再次进行腺病毒感染，如此循环，共进行三次腺病毒感染，完成人脐带间充质干细胞向胰岛β细胞的诱导分化；所述六种腺病毒的转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21。

【技术特征摘要】
1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中培养，得到贴壁生长的人脐带间充质干细胞；
2）用PBS清洗步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞，然后用胰酶消化收集；
3）将收集到的人脐带间充质干细胞用无血清的DMEM/F12培养基培养，同时添加六种腺病毒进行腺病毒感染，感染24小时后，用PBS清洗细胞，然后添加含有胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，培养三天后，PBS清洗，再次进行腺病毒感染，如此循环，共进行三次腺病毒感染，完成人脐带间充质干细胞向胰岛β细胞的诱导分化；所述六种腺病毒的转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21。
2.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）中，DMEM高糖培养基添加有胎牛血清FBS，碱性成纤维生长因子bFGF。
3.根据权利要求2所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述胎牛血清FBS的添加比例为10~20wt%，所述碱性成纤维生长因子bFGF的添加比例为10~100ng/mL。
4.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）中，人...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡祥，李陶，刘沐芸，李婵，丁长才，
申请(专利权)人：深圳市北科生物科技有限公司，辽宁北科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44