肾祖细胞制造技术

提供了一种用于同时生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，其包括使间介中胚层细胞与以下物质接触的步骤：成纤维细胞生长因子9和/或成纤维细胞生长因子20，和任选的选自以下的一种或多种：骨形态形成蛋白7；肝素；Wnt激动剂；视黄酸；和RA拮抗剂。可以操作Wnt激动剂、视黄酸和/或RA拮抗剂的浓度，以有利于肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的相对生产。所述间介中胚层细胞最终经由后原条阶段从人多能干细胞衍生出。所述肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞可能具有最终用途诸如用于肾修复和再生、肾的生物打印和筛查化合物的肾毒性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及肾发育。更具体地，本专利技术涉及从人多能干细胞生产肾单位祖细胞和最终生产输尿管祖细胞的体外方法。
技术介绍
由于全球晚期肾病的患病率上升至8％1，迫切需要肾再生策略。肾是通过输尿管芽(UB)的形成以及该芽与邻近的IM-衍生的后肾间充质(MM)之间的相互作用而从间介中胚层(IM)分化出的中胚层器官2。肾单位源自从MM衍生出的肾单位祖细胞群3。IM本身从后原条衍生出4。尽管肾的发育起源被较好地理解2，然而人肾中的肾单位形成在出生之前完成5。因此，不存在能够替代丧失的肾单位的出生后干细胞。人多能干细胞对于基于细胞的肾脏疾病治疗的产生而言具有巨大潜力。但是，关于如何生产所述必需细胞类型(其产生肾单位和肾的其它结构)的理解的缺乏，已经阻碍作为临床用细胞的来源和作为诸如肾脏疾病的治疗剂的人多能干细胞的实现。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人已经使用正常胚胎发生过程中所用的生长因子在完全化学成分确定的单层培养条件下成功地指导人多能干细胞穿过后原条和间介中胚层(IM)的分化。该分化方案导致输尿管芽(UB)和后肾间充质(MM)的同步诱导，所述后肾间充质(MM)在体外形成自组织结构，包括肾单位形成。这样的hESC-衍生的组分表现出广阔的离体肾潜力，从而证实基于多能干细胞的肾再生的潜力。因此，本专利技术的一个方面提供了一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使间介中胚层(IM)细胞与以下物质接触：成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)；和任选的一种或多种选自以下的试剂：骨形态形成蛋白7(BMP7)；肝素；Wnt激动剂；视黄酸(RA)、类似物或激动剂；和RA拮抗剂；以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。在一个实施方案中，所述IM细胞是从后原条细胞衍生出或分化出。在一个实施方案中，所述后原条细胞是从人多能干细胞(hPSC)衍生出或分化出。hPSC的非限制性例子包括人胚胎干细胞(hESC)和诱导的人多能干细胞(iPSC)。在一种优选形式中，该方面提供了一种方法，其包括以下相继步骤：(i)使hPSC与促进hPSC分化成后原条细胞的一种或多种试剂接触；(ii)使所述后原条细胞与促进后原条细胞分化成IM细胞的一种或多种试剂接触；和(iii)使IM细胞与FGF9接触，所述FGF9是单独的或与以下一种或多种组合：BMP7；RA；RA拮抗剂；Wnt激动剂；和/或FGF20；和肝素；以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。在步骤(ii)处的一种或多种试剂优选地包括FGF9。在一个特定实施方案中，FGF9存在于步骤(ii)和(iii)的至少一部分或完全贯穿其中。在一个特别优选的实施方案中，Wnt激动剂诸如CHIR99021存在于步骤(i)中。在一个实施方案中，所述方法进一步包括鉴别存活的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞的步骤。在某些实施方案中，鉴别存活的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞包括，测量或检测作为存活的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞的标志物的多种核酸和/或蛋白的共表达。在另一个方面，本专利技术提供了根据前述方面的方法生产的分离的、富集的或纯化的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞。在另一个方面，本专利技术提供了一种生产肾或肾细胞或组织的方法，所述方法包括以下步骤：从前述方面的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞分化出肾或肾细胞或组织，以由此生产所述肾或肾细胞或组织。在某些实施方案中，所述肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞可以用作生物打印或生物工程改造全肾和肾组织的来源，所述全肾和肾组织用于肾移植或治疗慢性肾脏疾病。在其它实施方案中，所述肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞可以用于整个器官去细胞化的肾的重新细胞化，以由此建立重构的或替代性的肾。在其它实施方案中，所述肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞可以用作肾疾病和病况的细胞疗法的来源。在另一个方面，本专利技术提供了一种确定一种或多种化合物的肾毒性的方法，所述方法包括以下步骤：使所述一种或多种化合物与前述方面的分离的或纯化的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞或从其分化出或以其它方式得到的肾细胞或组织接触，以由此确定所述一种或多种化合物是否是肾毒性的。在一个实施方案中，该方面提供了将肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞生物打印成用于肾毒性筛查的肾类器官。附图说明图1.后原条和间介中胚层从人胚胎干细胞的连续分化.a,从内细胞团至肾谱系的发育阶段的示意图。在每个阶段中显示的基因代表该阶段的特异性标志物。b,FACS分析(GFP和前向散射(FSC))显示了在3天培养以后用不同比例的BMP4/激活素A(ng/mL)或8μMCHIR99021诱导的MIXL1-GFP阳性的后原条细胞的百分比。hESC，开始细胞；无GF，用基础培养基培养3天。c,d,对于通过qRT-PCR分析评估的BMP4和激活素A(ng/mL)的每种比例，SOX17、BRACHYURY(T)和MIXL1在第3天时的相对表达(c)。不同浓度的CHIR99021的相同qRT-PCR分析(d)。误差棒是标准差(n＝3个实验)。e,从hESC至IM使用的分化方案的示意图。f,在第6天时的RT-PCR，显示了从第2天至第6天在有或没有200ng/mlFGF9存在下IM的标志物(PAX2、LHX1、OSR1)的表达。g,从第2天至第6天在有或没有200ng/mlFGF9存在下在第6天时PAX2蛋白阳性的细胞的百分比的定量。经由BMP4/激活素A(B/A)和CHIR99021(CHIR)的两个分化方案超过了80％诱导效率。误差棒是标准差(n＝5个场，共来自3个实验)。h，使用BMP4/激活素A(B/A)或CHIR99021(CHIR)经由后原条诱导在第6天时PAX2(红色)和LHX1(绿色)蛋白的存在和共表达(比例尺＝100μm)。i，qRT-PCR显示了从第2天至第6天整个FGF9的浓度梯度在第6天时IM(PAX2、LHX1)、PM(TBX6)和LPM(FOXF1)的标志物的表达。误差棒是标准差(n＝3个实验)。j,qRT-PCR显示了从第2天至第6天在有FGF9以及NOG或BMP4存在下在第6天时中胚层标志物的表达变化。误差棒是标准差(n＝3个实验)。k,在第6天时的IF，显示了用PAX2(红色)标记的主要IM群体和用TBX6(绿色)标记的不重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使间介中胚层(IM)细胞与以下物质接触：成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)；和任选的选自以下的一种或多种：骨形态形成蛋白7(BMP7)；肝素；Wnt激动剂；视黄酸(RA)、类似物或激动剂；和RA拮抗剂；以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.14 AU 2013902215;2013.11.27 AU 20139045801.一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括以下
步骤：使间介中胚层(IM)细胞与以下物质接触：成纤维细胞生长因子9(FGF9)
和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)；和任选的选自以下的一种或多种：骨形
态形成蛋白7(BMP7)；肝素；Wnt激动剂；视黄酸(RA)、类似物或激动剂；和
RA拮抗剂；以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中FGF9和/或FGF20是在选自以下范
围的浓度：约20ng至1μg/mL；约50-500ng/mL；约100-300ng/mL；和约200
ng/mL。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中BMP7以选自以下范围
的浓度存在：约25-75ng/mL；约35-60ng/mL；约45-55ng/mL；和约50ng/mL。
4.根据任意前述权利要求所述的方法，其中RA、类似物或激动剂会增加从
IM细胞开始的输尿管上皮祖细胞的相对生产。
5.根据任意前述权利要求所述的方法，其中RA、类似物或激动剂以选自以
下范围的浓度存在：约10pM至1μM；约30pM至0.5μM；约50pM至0.2μM；
和约0.1μM。
6.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述RA拮抗剂会增加从IM细
胞开始的肾单位祖细胞的相对生产。
7.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述RA拮抗剂以选自以下范
围的浓度存在：约0.50pM至10μM；约0.01μM至5μM；约0.1μM至5μM；
和约1μM。
8.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述Wnt激动剂会增加从IM
细胞开始的肾单位祖细胞的相对生产。
9.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述Wnt激动剂以选自以下范
围的浓度存在：约0.1μM至10μM；约0.2μM至5μM；和约1-2μM。
10.根据任意前述权利要求所述的方法，其中肝素以在约0.1-10μg/mL的范
围内的浓度存在。
11.根据任意前述权利要求所述的方法，其中使所述间介中胚层(IM)细胞与
单独的或者与以下一种或多种组合的FGF9接触约72-360小时：BMP7、RA、
RA拮抗剂、Wnt激动剂、FGF20和/或肝素。
12.根据任意前述权利要求所述的方法，其中从所述IM细胞同步地或同时
地生产所述肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
13.根据任意前述权利要求所述的方法，其包括使后原条细胞与促进所述后
原条细胞分化成所述IM细胞的一种或多种试剂接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其包括使人多能干细胞(hPSC)与促进
hPSC分化成所述后原条细胞的一种或多种试剂接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述hPSC是人胚胎干细胞或诱导
的人多能干细胞。
16.根据任意前述权利要求所述的方法，其包括以下相继步骤：
(a)使人多能干(hPCS)细胞与促进hPSC细胞分化成后原条细胞的一种或
多种试剂接触；
(b)...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅利莎·利特尔，高里实，
申请(专利权)人：昆士兰大学，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU