本发明专利技术公开了一种定向诱导绒山羊毛囊干细胞向毛囊细胞分化的方法，属于绒山羊毛囊干细胞的诱导分化领域。本发明专利技术通过向绒山羊毛囊干细胞中加入不同浓度的褪黑素进行诱导，发现浓度为500pg/ml的褪黑素可以有效的促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化。在整个诱导期，500pg/ml的褪黑素仅会诱导分化得到毛囊细胞，而不会诱导产生表皮细胞，而且诱导14d的分化效率最佳。本发明专利技术建立的外源褪黑素定向诱导绒山羊毛囊干细胞向毛囊细胞高效分化的方法，不仅操作简便，可重复性好，而且对毛囊干细胞的体外培养，尤其是对于毛囊干细胞体外高效定向诱导的命运决定等相关研究及应用具有重要的实际意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及绒山羊毛囊干细胞，尤其涉及定向诱导绒山羊毛囊干细胞向毛囊细胞 分化的方法，属于绒山羊毛囊干细胞的诱导分化领域。
技术介绍
毛囊来源干细胞(hairfolliclestemcells，FSC)是指存在于毛囊里的原始细 胞，它可以在体内外分化为不同类型的细胞。目前多数研究将定位于毛囊隆突部和外根鞘 的角质形成干细胞称为毛囊干细胞(Yasuyukietxl·，Implantedhairfolliclestem cellsformSchwanncellsthatsupportrepairofseveredperipheralnerves .PNAS，2005,102(49): 17734-17738.)。毛囊干细胞在光镜下观察呈立方形，体积偏小，折光 性能强，细胞大小较为均一，整体呈铺路石状生长，细胞核质比较大，有3-5个核仁，具有幼 稚细胞的形态特征。毛囊干细胞在体内大多处于静息的状态，一旦微环境发生改变，就会表 现出惊人的增殖能力。许多研究人员己经采用不同的方法分离得到了毛囊干细胞，其方法 主要有:流式细胞仪分选法、应用酶消化法、组织块法、差速贴壁法、显微分离法和免疫磁珠 法等。 褪黑素(melatonin，MLT)主要由哺乳动物及人类的松果体产生，是一种吲哚类化 合物/胺类激素，其分泌量昼夜不同，白天分泌量减少，夜晚分泌量增加。褪黑素学名为N-乙 酸-5-甲氧基色胺，分子式C13H16N2O2,相对分子质量为232.27，恪点116_118°〇，是一种部分 亲水性和高亲脂性的化合物，属中性偏弱酸性，不溶于水，溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶 剂，受热易分解，产品性状为白色或淡黄色结晶状粉末。研究表明，不论在山羊生绒期还是 非生绒期，皮下埋置褪黑激素都可以促进绒毛的生长。目前，关于褪黑素对毛囊来源干细胞分化的影响尚未见报道。因此，建立一种外源 褪黑素定向诱导绒山羊毛囊干细胞向毛囊细胞高效分化的方法，对于毛囊干细胞体外高效 定向诱导的命运决定等相关研究将具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种定向诱导绒山羊毛囊干细胞向毛囊细胞 分化的方法，该方法利用褪黑素定向诱导绒山羊毛囊干细胞向毛囊细胞高效分化，操作简 便，可重复性好，为毛囊干细胞体外培养及研究应用的开展奠定了基础。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种，包 括：向绒山羊毛囊干细胞中加入褪黑素进行诱导，然后对诱导分化的细胞进行鉴定，即得； 其中，所述褪黑素的使用浓度为100_700pg/ml;优选的，所述褪黑素的使用浓度为500-700pg/ml，最优选为500pg/ml。本专利技术所述诱导的时间为1-21天，优选为7-21天，最优选为 14天。本专利技术所述绒山羊毛囊干细胞为内蒙古白绒山羊毛囊干细胞。 绒山羊毛囊干细胞的制备方法为本领域技术人员所熟知，其方法主要包括:流式 细胞仪分选法、应用酶消化法、组织块法、差速贴壁法、显微分离法和免疫磁珠法等，具体的 绒山羊毛囊干细胞的制备方法可以参考文献"内蒙古白绒山羊毛囊来源干细胞的分离鉴定 及其褪黑素受体基因cDNA的克隆，王宏，内蒙古农业大学硕士学位论文，2014"，该方法操作 简单，按照流程可以重复再现。本专利技术分离纯化获得了大量的内蒙古白绒山羊毛囊来源干 细胞，且经过成脂诱导、成骨诱导、成神经诱导以及毛囊来源干细胞标记基因检测，鉴定为 毛囊干细胞。 绒山羊毛囊干细胞可以在体内外分化为不同类型的细胞。本专利技术发现褪黑素对毛 囊干细胞的增殖有促进作用，l〇〇pg/ml~700pg/ml浓度的褪黑素对毛囊干细胞增殖均具有 促进作用。通过检测诱导分化过程中的毛囊干细胞标记基因（β?整合素和S0X9)的表达量证 明，其中500pg/ml褪黑素为毛囊干细胞的最适增殖浓度，β?整合素和S0X9基因的相对表达 水平均显著高于其它浓度的褪黑素刺激组。 本专利技术通过检测褪黑素对毛囊干细胞诱导分化过程中的毛囊细胞标记基因（KAP7 和KAP8)的表达量变化发现，100pg/ml~700pg/ml浓度的褪黑素可以促进毛囊干细胞向毛 囊方向分化，但最适分化浓度为500pg/ml，毛囊细胞标记基因KAP7和KAP8基因的表达量均 显著高于其它浓度的褪黑素刺激组。而且刺激诱导时间的实验表明，500pg/ml褪黑素诱导 刺激毛囊干细胞7-21天均会得到分化的毛囊细胞，但刺激14d的效率最佳，显著优于其它诱 导时间。在整个诱导期，500pg/ml褪黑素诱导刺激毛囊干细胞仅仅会得到分化的毛囊细胞， 而不会诱导分化产生表皮细胞。 本专利技术中，所述向绒山羊毛囊 干细胞中加入褪黑素进行诱导，包括以下步骤：（1)将绒山羊毛囊干细胞以IX1〇4个细胞/ 孔的密度接种于细胞培养板，补足干细胞培养液至500μ1/孔，培养过夜；（2)次日，更换含有 所述浓度褪黑素的干细胞培养液，培养细胞，即得。其中，所述培养细胞为37°C，5%C02,饱 和湿度的培养箱中培养，每隔3-4天换液一次。所述干细胞培养液为:DMEM/F12+10 %FBS+ 1%PS+EGF20ng/mL+ITS10yl/mL〇 本专利技术方法中，对诱导分化的细胞进行鉴定包括:提取诱导分化的细胞的总RNA， 反转录为cDNA;然后设计特异引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，例如采用实时定量PCR扩 增，检测毛囊细胞标记基因的表达情况;如果检测到毛囊细胞标记基因呈阳性表达，则鉴定 诱导分化的细胞为毛囊细胞。其中，所述毛囊细胞标记基因为KAP7基因或KAP8基因中的任 意一种或两种。KAP基因的表达情形随角化细胞的分化情况而变化，而且毛囊细胞的分化进 程被有时间顺序的一系列KAP基因所决定。内蒙古白绒山羊的KAP7、KAP8基因在分类上都是 属于高甘氨酸、酪氨酸家族的。在毛囊干细胞的分化过程中，其中KAP7和KAP8基因均表达于 绒山羊的初、次级毛囊中，可以作为毛囊细胞的标记物。本专利技术为保证实验结果真实稳定， 用β-actin或GADPH基因中的任意一种或两种作为内参基因。 本专利技术技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果： 本专利技术建立了一种外源褪黑素定向诱导绒山羊毛囊干细胞向毛囊细胞高效分化 的方法，该方法不仅操作简便，可重复性好，而且为真正意义上毛囊干细胞体外培养及相关 研究、应用的开展提供了技术基础，对于毛囊干细胞体外高效定向诱导的命运决定等相关 研究具有重要的意义。【附图说明】 图1为毛囊来源干细胞的分离培养(100X);其中，A:分离的毛囊;B:分离的毛囊;C: 毛囊来源干细胞原代培养lh;D:毛囊来源干细胞原代培养3d; 图2为毛囊来源干细胞的纯化培养（100X);其中，A:毛囊来源干细胞P1代6d(纯化 前）；B，毛囊来源干细胞P2代6d(纯化后）； 图3为毛囊来源干细胞的传代培养（100X);其中，A:毛囊来源干细胞P3代6d;B:毛 囊来源干细胞P5代6d; 图4为毛囊来源干细胞形成的单克隆（100X);其中，A:P3(传代培养的3代)毛囊来 源干细胞单克隆;B:P5(传代培养的5代)毛囊来源干细胞单克隆;C:P8(传代培养的8代)毛 囊来源干细胞单克隆； 图5为毛囊来源干细胞的形态观察;其中，A:毛囊来源干细本文档来自技高网...
【技术保护点】
定向诱导绒山羊毛囊干细胞向毛囊细胞分化的方法，包括：向绒山羊毛囊干细胞中加入褪黑素进行诱导，然后对诱导分化的细胞进行鉴定，即得；其特征在于：所述褪黑素的使用浓度为100‑700pg/ml。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高峰，刘迎春，周欢敏，曹春花，吴凯峰，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15
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