一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法。本发明专利技术将胚胎干细胞摇动培养或悬浮培养为拟胚体，然后将拟胚体贴壁培养，逐渐生长分化为圆形的分化细胞群落，根据分化肝细胞在圆形细胞群落中的空间分布规律，在特定时期选择特定区域的细胞进行分选并重新贴壁培养。在上述贴壁培养过程中，根据细胞分化情况，选择EGF、TGF、HGF、OSM等作为拟胚体向肝细胞分化过程中的肝性生长因子，以促进肝细胞分化，整个分选过程操作简单、成本低、可明显减轻细胞损伤、干细胞分化率相较于现有技术得到大幅度提高，分选后的细胞生长状态良好，可满足肝细胞移植的细胞纯度和细胞功能要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方 法。
技术介绍
既往胚胎干细胞分化中的细胞分选需要利用胰酶消化细胞并离心吹打等，造成细 胞严重损伤，不利于细胞移植应用。因为胚胎干细胞向肝细胞分化时，胚胎干细胞经悬浮培 养形成拟胚体(embryonic body，EB)，这相当于体内胚胎的囊胚，然后拟胚体再贴壁生长并 向肝细胞方向分化。每个拟胚体包含大量细胞，细胞与细胞之间以及其与培养瓶底部紧密 连接，甚至难以分清细胞界限。如果需要将阳性细胞分选，就需要用胰酶消化细胞，使各个 细胞之间以及与培养瓶底部之间分离，再用抗体标记细胞后，用流式细胞仪(FCM)或磁珠分 选将所需要的阳性细胞分选出来。这种分选方法经过胰酶的消化和FCM等机器分选操作，严 重影响细胞活力，细胞生长状态明显变差，很难完成后续的细胞移植实验。 如何在不影响细胞活力的前提下，将胚胎干细胞分化的肝细胞初步分选出来并在 新的培养系统中再培养，以提高其分化纯度，用于后续的肝细胞移植是当前的难题。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的目的在于提供一种胚胎干细胞分化的 肝细胞的分选方法。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现： -种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，包含如下步骤： (1)胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC)在拟胚体（embryonic body，EB)液体 培养基中摇动培养或悬浮培养开始分化，得到拟胚体； (2)将步骤(1)得到的拟胚体进行贴壁培养，每个拟胚体以贴壁点为中心向四周辐 射分化生长形成细胞分化群落;胚胎干细胞分化至第15d时，刮取位于细胞分化群落区域1 和/或细胞分化群落区域2的正常生长状态细胞，将其再次贴壁培养，得到胚胎干细胞分化 的肝细胞； 步骤(1)中所述的胚胎干细胞优选为BALB/c系小鼠胚胎干细胞； 步骤(2)中所述的区域1为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落 中心的距离不超过细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离）的1/4; 步骤(2)中所述的区域1优选为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化 群落中心的距离不超过细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的1/5; 步骤(2)中所述的区域2为细胞分化群落区域3之外的区域； 所述的区域3为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离 为细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的3/4; 所述的区域3优选为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的 距离为细胞分化群落半径(细胞分化群落边缘至中心距离)的4/5; 步骤（1)中所述的摇动培养或悬浮培养的目的在于:使细胞在培养液中处于悬浮 状态，避免贴壁，以利于其分化发育为圆球形的拟胚体； 步骤(1)中所述的拟胚体液体培养基优选由基础培养基和添加物组成； 所述的基础培养基优选为DMEM培养基;所述的添加物包含如下组分:体积分数为 20 %的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的 青霉素和终浓度为l〇〇yg/mL的链霉素； 步骤(1)中所述的摇动培养或悬浮培养的时间优选为培养6天； 步骤⑵中所述的贴壁培养的培养基优选由基础培养基和添加物组成； 所述的基础培养基优选为DMEM培养基;所述的添加物包含如下组分:体积分数为 20 %的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的 青霉素和终浓度为l〇〇yg/mL的链霉素； 步骤(2)中所述的贴壁培养过程中添加肝性生长因子；所述的肝性生长因子为EGF、TGF、HGF、0SM、地塞米松、胰岛素和转铁蛋白中的至少 一种； 所述的肝性生长因子加入时间和用量优选为： 胚胎干细胞分化第7天~19天(本专利技术中的分化天数是从胚胎干细胞首次分化开 始计），加入终浓度为30ng/mL的EGF和终浓度为30ng/mL的TGF; 胚胎干细胞分化第7天~10天，加入终浓度为20ng/mL的HGF; 胚胎干细胞分化第11~19天，终浓度为40ng/mL的HGF; 胚胎干细胞分化第15~19天，加入终浓度为10ng/mL的0SM、终浓度为10-7Μ的地塞 米松、终浓度为5yg/mL的胰岛素和终浓度为5yg/mL的转铁蛋白；胚胎干细胞拟胚体进行贴壁培养过程中，加入EGF、HGF等肝性生长因子后，细胞分 化群落外周形成比较均一的细胞群，说明生长因子的定向诱导作用使拟胚体向单一类型细 胞分化； 本专利技术的原理： 本专利技术是基于对胚胎干细胞向肝细胞分化中的每个胚胎干细胞分化群落的空间 形态学观察结果，得出的一种新的细胞分选方法:胚胎干细胞首先经5~6d悬浮发育为拟胚 体，拟胚体相当于体内胚胎发育中的囊胚，然后拟胚体再贴壁，形成细胞分化群落并进一步 向肝细胞分化，每个细胞分化群落一开始大约包含500~600个细胞，随着分化分裂，细胞数 量不断增多并呈分散性生长为圆形细胞群落，经过肝性标记物(如白蛋白）免疫荧光检测， 我们发现阳性标记的肝细胞处于每个细胞分化群落的区域1和区域2;本专利技术在特定时期 (胚胎干细胞分化至第15d)选择并分选区域1和区域2(图2)的细胞重新进行贴壁培养，在贴 壁培养过程中，本专利技术根据细胞分化情况，选择EGF、TGF、HGF、0SM、地塞米松、胰岛素和转铁 蛋白等作为拟胚体向肝细胞分化过程中的肝性生长因子，在不同分化阶段添加合适的肝性 生长因子，以促进肝细胞分化，整个分选过程操作简单、成本低、可明显减轻细胞损伤、干细 胞分化率相较于现有技术得到大幅度提高，分选后的细胞生长状态良好，可满足肝细胞移 植的细胞纯度和细胞功能要求。 本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本专利技术是基于拟胚体细胞分化群落中肝细胞的独特的空间分布规律，得出的 一种新的细胞分选方法。 (2)本专利技术利用物理性的活体细胞整块刮取方法，将整片区域的细胞整块刮取，可 很好的保护单个细胞的功能，相比普通的胰酶消化细胞方法，具有明显减轻细胞损伤的优 点。 (3)本专利技术在不影响细胞活力的情况下，经过多次整块刮取细胞，并重新培养，可 以完全达到满足细胞移植时的纯度(大于80 % )需求。 (4)本专利技术在不同分化阶段添加合适的肝性生长因子，以促进肝细胞分化，干细胞 分化率相较于现有技术得到大幅度提高。【附图说明】 图1是胚胎干细胞体外向肝细胞分化的细胞形态图；其中，A:胚胎干细胞;B:拟胚 体;C:细胞分化群落。 图2是本专利技术细胞分选过程中区域1和区域2的示意图。 图3是细胞分选前后，显微镜下细胞分化群落或制得的肝细胞形态图；其中，A:细 胞分选前细胞分化群落形态;B:细胞分选后制得的肝细胞形态。【具体实施方式】下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限 于此。拟胚体液体培养基由基础培养基和添加物组成;基础培养基优选为DMEM培养基； 添加物包含如下组分:体积分数为20 %的胎牛血清、终浓度为0.1M的2-巯基乙醇、终浓度为 25mM的HEPES、终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100yg/mL的链霉素； 实施例1 (1)BALB/c系小鼠胚胎干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胚胎干细胞分化的肝细胞的分选方法，其特征在于包含如下步骤：(1)胚胎干细胞在拟胚体液体培养基中摇动培养或悬浮培养开始分化，得到拟胚体；(2)将步骤(1)得到的拟胚体进行贴壁培养，每个拟胚体以贴壁点为中心向四周辐射分化生长形成细胞分化群落；胚胎干细胞分化至第15d时，刮取位于细胞分化群落区域1和/或细胞分化群落区域2的正常生长状态细胞，将其再次贴壁培养，得到胚胎干细胞分化的肝细胞；步骤(2)中所述的区域1为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离不超过细胞分化群落半径的1/4；步骤(2)中所述的区域2为细胞分化群落区域3之外的区域；所述的区域3为位于细胞分化群落中心区域且其边缘至细胞分化群落中心的距离为细胞分化群落半径的3/4。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡安斌，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44