诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞技术

本发明专利技术涉及一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞。该方法通过在定向诱导分化的不同阶段加入不同的培养基进行诱导性多能干细胞的定向诱导分化。该方法在操作过程中可以随时观察细胞形态的变化，确保诱导的正常进行，可以快捷且高效地诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无饲养层细胞的培养体系，仅通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导周期较短、效率高，且得到的肝细胞性能稳定，功能成熟，不存在基质细胞污染的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞。
技术介绍
异体肝脏移植被认为是目前治疗终末期肝病的最有效手段，移植后长期生存率可达70％-85％。然而有限的肝脏供体远远不能满足临床需求，据报道，等待肝移植的患者在等待期病死亡率达15％。目前针对肝功能衰竭的其他治疗方法包括通过膜滤或树脂交换作用的体外人工肝、体外应用同种或异种肝细胞的生物人工肝以及体内肝细胞移植等。上世纪70年代以细胞为基础治疗引起广泛关注，人胎肝治疗有着很好的临床的效果。向德栋等选取了40例慢性重型乙型肝炎患者，均有不同程度的乏力、纳差、腹胀等消化道症状，在20例患者中采用非生物人工肝联合肝胎细胞悬液治疗重型肝炎，有8例患者病情自然恢复，4例患者成功过度行肝移植治疗，好转存活率达60％，采用单纯非生物人工肝支持治疗好转存活率仅为45％，其疗效不如非生物人工肝联合肝胎细胞悬液治疗。郑宣鹤等采用血浆置换联合胎肝细胞悬液治疗138例患者，临床好转存活99例，有效提高了重型肝炎患者的好转治愈率，疗效优于单用胎肝细胞悬液或血浆置换组，而单用血浆置换组与单用肝胎细胞悬液组差异无显著性，该结果与大岛宣雄等单用血浆置换治疗117例患者，存活率仅24％等报道结果相符。但是因胎肝来源等存在伦理问题，人胎肝治疗已被禁止。有研究表明通过对慢性肝衰竭患者进行MSC(MesenchymalStemCell，间充质干细胞)移植，可以改善肝功能和临床症状，且未出现严重不良反应。并且MSC不表达MHC-Ⅱ类分子，低表达甚至不表达MHC-Ⅰ类分子，几乎不存在免疫排斥问题。但是自体骨髓MSC也具有一定的局限性：如患者凝血功能差影响骨髓采集、患者自体细胞数量不足及增殖活性低下，因而限制了临床应用。随着2007年11月，美国和日本的两个研究小组几乎同时宣布成功将人体皮肤细胞改造成几乎可以和胚胎干细胞相媲美的诱导性多能干细胞---“iPS细胞”，回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植免疫排斥问题，在生命科学基础研究和医学领域的优势已日趋明显。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞。一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，包括如下步骤：步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；步骤S2，将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM-1640培养基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；步骤S3，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；步骤S4，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。在其中一个实施例中，在所述步骤S1中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化为诱导性多能干细胞；所述诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。在其中一个实施例中，在所述步骤S2中，使用所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM-1640培养基培养22-50小时后，更换使用所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM-1640培养基培养46-98小时，并且在后续培养过程中每22-26小时更换一次培养基。在其中一个实施例中，所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM-1640培养基中所述人活化素A的浓度为5-300ng/ml，所述Wnt3a的浓度为20-100ng/ml。在其中一个实施例中，所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM-1640培养基中所述人活化素A的浓度为10-200ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为0.2-2％。在其中一个实施例中，在所述步骤S3中，使用所述添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基培养22-98小时后，再使用添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基培养118-170小时，并且在培养过程中，每隔22-26小时更换一次相应的培养基。在其中一个实施例中，所述添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中所述角质细胞生长因子的浓度为15-100ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为2-3％。在其中一个实施例中，所述添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基中所述血清替代物的体积浓度为20％，所述L-谷氨酰胺的浓度为1-3mM，所述非必需氨基酸的质量浓度为0.1-15％，所述β-巯基乙醇的浓度为0.1-0.12mM，所述二甲基亚砜的体积浓度为0.2-2％。在其中一个实施例中，在所述步骤S4中，培养周期为142-242小时，且每个22-26小时更换一次培养基。在其中一个实施例中，所述添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中所述胎牛血清的体积浓度为10％，所述肝细胞生长因子的浓度为10-300ng/ml，所述抑瘤素的浓度为1-150ng/ml，所述地塞米松的浓度为0.05-1.2μM，所述L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。本专利技术还提供了一种采用上述任一实施例所述的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法构建得到的肝细胞。本专利技术通过合理的使用细胞生长因子提供一种优化的诱导性多能干细胞在体外条件下定向诱导分化为肝脏前体细胞的方法，该方法在操作过程中可以随时观察细胞形态的变化，确保诱导的正常进行，可以较为快捷且高效地诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无feeder(饲养层细胞)的培养体系，仅通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导周期较短、效率高，且得到的肝细胞性能稳定，不存在基质细胞污染的问题。附图说明图1为本专利技术实施例中hiPS诱导形成过程中细胞形态变化示意图，其中，A：人胚胎成纤维细胞，B：病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；步骤S2，将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM‑1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM‑1640培养基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；步骤S3，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L‑谷氨酰胺、非必需氨基酸、β‑巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；步骤S4，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L‑谷氨酰胺的L‑15培养基中，促进肝细胞成熟。

【技术特征摘要】
1.一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，包
括如下步骤：
步骤S1，提供或制备诱导性多能干细胞；
步骤S2，将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素A和Wnt3a
的RPTM-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素A及胎牛血清的
RPTM-1640培养基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；
步骤S3，将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和
胎牛血清的KO/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷
氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇及二甲基亚砜的KO/DMEM培养基，使培
养的细胞向肝系细胞定向诱导分化；
步骤S4，将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因
子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。
2.如权利要求1所述的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，
其特征在于，在所述步骤S1中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、miRNA
导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化
为诱导性多能干细胞；所述诱导因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。
3.如权利要求1所述的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，
其特征在于，在所述步骤S2中，使用所述添加有人活化素A和Wnt3a的
RPTM-1640培养基培养22-50小时后，更换使用所述添加有人活化素A及胎牛
血清的RPTM-1640培养基培养22-50小时，并且在后续培养过程中每22-50小
时更换一次培养基。
4.如权利要求1或3所述的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方
法，其特征在于，所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM-1640培养基中所
述人活化素A的浓度为5-300ng/ml，所述Wnt3a的浓度为20-100ng/ml。
5.如权利要求4所述的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，
其特征在于，所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM-1640培养基中...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙懿，林戈，卢光琇，
申请(专利权)人：湖南光琇高新生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43