利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用转录因子转染牛体细胞产生诱导性多能干细胞（ｉＰＳＣｓ）的方法，具体包括下列步骤：１）牛皮肤成纤维细胞的分离与培养；２）牛维持多能性基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建；３）逆转录病毒的包装与准备；４）逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的ｉＰＳ细胞的获得。本发明专利技术首次采用脱细胞后人羊膜作为支持物代替小鼠胚胎成纤维细胞来维持牛ｉＰＳＣｓ体外增殖并长期保持未分化的多能性状态。这种采用基因诱导产生多能性干细胞的策略，不但解决了家畜特别是牛多能性干细胞难以获得的技术难题，而且避免了应用鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞的饲养层所带来的异种动物细胞污染问题。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：　　１）牛皮肤成纤维细胞的分离与培养　　以成年牛皮肤成纤维细胞ＢＤＦｓ和新生牛皮肤成纤维细胞ＮＤＦｓ经常规培养分别获得大量的成年牛皮肤成纤维细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；　　２）牛维持多能性基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建　　从５０－６０日龄牛胎儿中分离生殖嵴，提取总ＲＮＡ，经过逆转录反应得到ｃＤＮＡ；以ｃＤＮＡ为模板，经过ＰＣＲ反应得到牛Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２和Ｋｌｆ４三个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因插入到逆转录病毒载体ｐＭＳＣＶｎｅｏ中，构建这３种基因的逆转录病毒表达载体；　　３）逆转录病毒的包装与准备　　将ＰＴ６７包装细胞按照常规方法培养在含有１５％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中，应用脂质体将构建的逆转录病毒转染进入包装细胞ＰＴ６７细胞；将８μｇ含有Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２和Ｋｌｆ４三个不同基因的逆转录病毒表达载体质粒和３份２０μｌ转染试剂脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００分别用５００μｌ　Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ－Ｉ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ转染优化液进行稀释，轻轻混匀，室温下孵育５分钟，然后将含有脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００的稀释液缓慢滴入含有逆转录病毒质粒的稀释液中，轻轻混匀，室温下再孵育２０分钟后，然后将上述混合液逐滴加入ＰＴ６７包装胞培养皿中；转染２４小时后，每天更换含有病毒颗粒培养液一次，连续３天，收集病毒悬浮液，在４℃条件下经２５０００转／分离心９０分钟后，１０倍浓缩病毒上清液；将含有Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２和Ｋｌｆ４三个基因病毒上清液进行等量混合，并加入８μｇ／ｍｌ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ组成特定的三因子基因组合，－８０℃保存备用；　　４）逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的ｉＰＳ细胞的获得　　将成年牛皮肤成纤维细胞ＢＤＦｓ和新生公牛皮肤成纤维细胞ＮＤＦｓ按照常规方法培养在６０ｍｍ塑料培养皿中，待培养皿中细胞生长到７０－８０％融合时将包含Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２和Ｋｌｆ４基因转录因子的逆转录病毒上清液混合液大约５ｍｌ分别加入到成纤维细胞ＢＤＦｓ与ＮＤＦｓ培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满培养皿后按１：３常规传代，视细胞生长情况在第６－１０ｄ将细胞以１×１０５细胞／孔的密度，转移至预先铺有人羊膜（ＨＡＭ）的６孔培养板上，作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成特制的干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈冬梅，吕长荣，辛晓玲，窦忠英，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61[中国|陕西]