扩增制造技术

本申请提供了一种扩增

【技术实现步骤摘要】
扩增PKD1基因外显子的试剂盒及方法


[0001]本申请涉及分子生物学
，特别是涉及扩增
PKD1
基因外显子的试剂盒及方法
。

技术介绍

[0002]多囊肾
(polycystic kidney)
又名
Potter(I)
综合征
、Perlmann
综合征，先天性肾囊肿瘤病
、
囊胞肾
、
双侧肾发育不全综合征等，是一种较常见的遗传性疾病
。
多囊肾病是继慢性肾小球肾炎
、
糖尿病肾病和良性肾小动脉硬化导致肾功能衰竭的第四大病因，常累及全身多个系统
。
主要表现为两侧肾病变进展不对称，大小有差异，至晚期两肾可占满整个腹腔，肾表面布有很多囊肿，使肾形不规则，凹凸不平，最终导致终末期肾病
。
多囊肾按遗传方式可分为常染色体显性
(
成人型
)
多囊肾病
(autosomal dominant polycystickidney disease
，
ADPKD)
和常染色体隐性
(
婴儿型
)
多囊肾病
(autosomalrecessive polycystic kidney disease
，
ARPKD)。
常染色体隐性多囊肾的发病率约为
1/20 000
，多见于婴儿，且多在早年死亡，临床较为罕见，该型的发生主要与
PKHD1
基因突变相关
。
常染色体显性多囊肾的发生率为
1/500
‑
1000
人，可在任何年龄发病，多见于成人，临床表现主要有肾脏肿大
、
血尿
、
蛋白尿
、
高血压，晚期可发生肾功能衰竭
。
多囊肾病的目前治疗主要是积极控制高血压等并发症和防治感染，保护肾功能，延缓尿毒症到来
。
出现尿毒症时可作透析治疗和肾移植
。
[0003]基因解码研究表明
ADPKD
的致病基因主要由
PKD1、PKD2
两个基因突变引起，其中约
85
‑
90
％的患者为
PKD1
基因突变导致的，约
10
‑
15
％为
PKD2
基因突变，
PKD1
是成人型多囊肾的主要致病基因
。
通过基因解码技术可以明确病因
。
随着
PKD1
基因各种突变类型的不断被发现，基因解码专家将重点关注基因突变类型与囊肿形成的相关性
。。
[0004]PKD1
基因编码的蛋白为多囊蛋白
1(PC1)
，是
11
次跨膜大分子蛋白，主要表达在肾小管上皮细胞的细胞膜表面，负责将细胞外环境信号传递给胞内信号分子
。PKD1
基因位于染色体
16p13.3
区，基因体长达
52kb
，共有
46
个外显子，编码区长达
12906bp。PKD1
基因在
16
号染色体上存在6个与其同源的假基因，假基因与
PKD1
基因1‑
34
号外显子序列同源性高达
97.7
％，大约
80
％的致病突变发生在此区域
。
[0005]上述
PKD1
的基因复杂的结构特点和突变特点，给
PKD1
基因检测带来的巨大的困难
。
传统的检测
PKD1
基因的方法各有缺陷，例如常规的
PCR
或二代测序等方法难以特异性地将
PKD1
真基因靶向富集并检测，而利用三代测序方法检测
PKD1
，成本相对较高
。
由于在
PKD1
基因扩增实验过程中容易扩增到同源序列，造成扩增失败，检测效率低，目前针对
PKD1
基因2‑
34
号外显子的
PCR
扩增通常都是分几个片段来扩增，需要采用多次甚至是不同的
PCR
反应条件之后才能完成整个基因的扩增，用时较长，效率较低，增加了扩增成本
。
虽然有研究通过长片段
PCR
和高通量测序技术检测
PKD1
基因的方法可以采用相同的扩增反应条件，但在多管长片段
PCR
方法中，其中任何一个
LR
‑
PCR
扩增失败，均需要重新制备，这种方法前期处理的工作量大，程序复杂
。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要提供一种扩增
PKD1
基因外显子的试剂盒及方法，用于低成本
、
高效地扩增
PKD1
基因外显子，不会扩增到同源序列
。
[0007]本申请提供了一种扩增
PKD1
基因外显子的试剂盒，包括
PCR
反应试剂1和
PCR
反应试剂2中的至少一种；
[0008]其中，
PCR
反应试剂1包括：用于扩增
PKD1
基因2‑
34
号外显子长片段的引物对；用于扩增
PKD1
基因2‑
34
号外显子长片段的引物对的序列如
SEQ ID NO:1
和
SEQ ID NO:2
所示；
[0009]PCR
反应试剂2包括：用于分别扩增
PKD1
基因第2号至第
34
号外显子的扩增引物组合；用于分别扩增
PKD1
基因第2号至第
34
号外显子的扩增引物组合的序列分别如
SEQ ID NO:3
‑
SEQ ID NO:56
所示
。
[0010]在其中一个实施例中，所述试剂盒包括所述的
PCR
反应试剂1和
PCR
反应试剂
2。
[0011]在其中一个实施例中，所述
PCR
反应试剂1还包括
DNA
聚合酶
、PCR
缓冲液
、dNTPs
以及
Mg
2+
中的至少一种
。
[0012]在其中一个实施例中，所述
DNA
聚合酶为
KOD DNA
聚合酶
。
[0013]在其中一个实施例中，所述...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种扩增
PKD1
基因外显子的试剂盒，其特征在于，包括
PCR
反应试剂1和
PCR
反应试剂2中的至少一种；其中，
PCR
反应试剂1包括：用于扩增
PKD1
基因2‑
34
号外显子长片段的引物对；用于扩增
PKD1
基因2‑
34
号外显子长片段的引物对的序列如
SEQ ID NO:1
和
SEQ ID NO:2
所示；
PCR
反应试剂2包括：用于分别扩增
PKD1
基因第2号至第
34
号外显子的扩增引物组合；用于分别扩增
PKD1
基因第2号至第
34
号外显子的扩增引物组合的序列分别如
SEQ ID NO:3
‑
SEQ ID NO:56
所示
。2.
根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括所述的
PCR
反应试剂1和
PCR
反应试剂
2。3.
根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述
PCR
反应试剂1还包括
DNA
聚合酶
、PCR
缓冲液
、dNTPs
以及
Mg
2+
中的至少一种
。4.
根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述
DNA
聚合酶为
KOD DNA
聚合酶
。5.
根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述
PCR
反应试剂2还包括
PCR
预混液
。6.
一种扩增
PKD1
基因外显子的方法，其特征在于，包括使用如权利要求1‑5任一项所述的试剂盒进行
PCR
扩增反应的步骤
。7.
根据权利要求6所述的扩增
PKD1
基因外显子的方法，其特征在于，包括如下步骤：获取样本的基因组
DNA
；向所述基因组
DNA
中加入权利要求1‑5任一项所述试剂盒的
PCR
反应试剂1进行第一次
PCR
扩增反应，获得第一次
PCR
产物；向所述
PCR
产物中加入权利要求1‑5任一项所述试剂盒的
PCR
反应试剂2进行第二次
PCR
扩增反应，获得第二次
PCR
产物
。8.
根据权利要求7所述的扩增
PKD1
基因外显子的方法，其特征在于，第一次
PCR
扩增反应的条件包括：
93℃
‑
95℃
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李双飞，杜娟，何文斌，林戈，李汶，张前军，
申请(专利权)人：湖南光琇高新生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：