利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用转录因子转染牛体细胞产生诱导多能干细胞（ｉＰＳＣｓ）的方法，具体包括下列步骤：１）牛皮肤成纤维细胞的分离与培养；２）牛维持多能性转录因子基因的克隆及其逆转录病毒载体的构建；３）逆转录病毒的包装与准备；４）逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的诱导性多能干细胞的获得。本发明专利技术首次采用脱细胞后人羊膜作为支持物代替小鼠胚胎成纤维细胞来维持牛ｉＰＳＣｓ体外增殖并长期保持未分化的多能性状态。这种采用基因诱导产生多能性干细胞的方法，不但解决了动物特别是如牛、羊、猪等家畜多能性干细胞难以获得的技术难题，而且避免了应用鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞的饲养层所带来的异种动物细胞污染问题。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法，包括如下步骤：　　１）牛皮肤成纤维细胞的分离与培养以成年牛皮肤成纤维细胞ＢＤＦｓ和新生牛皮肤成纤维细胞ＮＤＦｓ，经常规培后养分别获得大量的成年牛皮肤细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；　　２）牛维持多能性转录因子基因的克隆及其逆转录病毒载体的构建从５０－６０日龄牛胎儿中分离生殖嵴，提取总ＲＮＡ，经过逆转录反应得到ｃＤＮＡ；以ｃＤＮＡ为模板，经过ＰＣＲ反应得到牛Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ和Ｌｉｎ２８四个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因插入到逆转录病毒载体ｐＭＳＣＶｎｅｏ中，构建这４种基因的逆转录病毒表达载体；　　３）逆转录病毒的包...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕长荣，陈冬梅，辛晓玲，窦忠英，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61[中国|陕西]