本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及到一种体外诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hADSCs)向有功能肝细胞(iHeps)分化的方法。该方法包括的步骤为：分离出hADSCs；体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为4个阶段：预处理阶段；内胚层诱导阶段；成肝诱导阶段；肝细胞的成熟阶段。使用本发明专利技术的诱导分化方法，只需要十天左右的时间就足够产生具有肝细胞形态，基因表达及功能的肝细胞，是目前用时最短的非转基因法实现肝细胞分化的方法。这将有利于个体化临床治疗方案的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及到一种体外诱导人脂肪来源的间充质干 细胞(hADSCs)向有功能肝细胞(iH印s)分化的方法。
技术介绍
肝脏是一个调节多种生理过程的关键器官。肝脏疾病，如肝炎、肝硬化以及爆发性 肝损伤，是导致死亡的重要原因。原位肝移植(0LT)是目前治疗终末期肝脏疾病的唯一方 法，但由于免疫排斥等副作用及其肝脏供体的短缺限制了肝移植的临床应用。肝细胞移植 是治疗肝功能不全的整体肝移植的替代疗法;虽然原代肝细胞可以从供体肝脏中分离得 到，但每次移植需要1~5X10 9个肝细胞，这就需要获得大量的供体肝或大量的可体外扩增 的原代肝细胞。供体肝脏的缺乏和原代肝细胞体外扩增困难等原因使得获得充足的可用于 细胞治疗的肝细胞非常困难。为了解决目前这种窘境，迫切需要可快速产生大量肝细胞的 新方法。 过去几年，发现了多种可用于治疗肝脏疾病的肝外细胞群，其中具有多向分化潜 能和半无限增殖能力的间充质干细胞(MSCs)就是一种重要的具有潜在应用价值的细胞。间 充质干细胞可从骨髓、脂肪、脐带血、羊膜液、头皮、胎盘等多种组织中获得。其中，脂肪来源 的MSCs(ADSCs)被认为是最有应用前景的一类间充质干细胞，其在脂肪组织的占比介于1: 100到1:500之间，远高于骨髓间充质干细胞在骨髓中所占比例，在再生医学中有良好的应 用前景。ADSCs来源充足，易得到，创伤小，可取材于患者自身的脂肪组织，这样就避免了免 疫排斥反应，也解决了伦理问题等的障碍。已有研究表明ADSCs在体外具有诱导分化成肝细 胞的潜力。 目前的技术由ADSCs向肝细胞诱导分化都需要大约1个月的时间，使得这些诱导分 化方法并不适用于实际临床应用。而临床应用需要尽可能缩短体外诱导分化的时间。因此， 开发新的能在短时间内将ADSCs高效地诱导成为成熟肝细胞（iHeps)的方法是本领域的一 个难题。
技术实现思路
本专利技术要求解决的技术问题是现有ADSCs诱导成为iHeps的方法耗时长，效率低的 缺陷。 本专利技术解决技术问题的技术方案是提供一种新的体外诱导hADSCs向iHeps分化的 方法。该方法包括以下步骤： a、从人的离体脂肪组织中分离出hADSCs; b、体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下4个阶段： 预处理阶段:在步骤a分离得到的hADSCs中加入含有0.5~2μΜ的ATRA的RPMI-1640 培养基或DMEM/F12培养基，进行诱导培养，诱导时间为20~28小时； 内胚层诱导阶段:将预处理后的hADSCs在含有浓度为50~200ηΜ的IDE1、1~5μΜ 的CHIR99021和5~20μΜ的LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培 养，诱导时间为20~28小时；成肝诱导阶段:完成内胚层诱导后的细胞在含有浓度为50~200nM的IDE1、10~ 30ng/mL 的 FGF4、5~20μΜ 的LY294002 和 50~200nM 的LDN-193189 的 RPMI-1640 培养基或 DMEM/F12培养基中诱导培养36~60小时；接着加入含有浓度为50~200nM的IDE1、10~ 30ng/mL的纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5~20μΜ的LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/ F12培养基中继续进行诱导培养20~28小时；肝细胞的成熟阶段:完成了成肝诱导后的细胞在含有浓度为1〇〇~200ng/mL的肝 细胞生长因子(HGF)、10~30ng/mL的纤维母细胞生长因子4(FGF4)、20~40ng/mL抑瘤素 Μ (〇81〇、1.5~3\10_5!11〇1/1地塞米松(〇61)以及1了3预混通用培养添加物的啊111&1118 1培养 基中进行成熟阶段的诱导培养，培养时间为112~144小时;得到由hADSCs分化而来的iHeps 细胞。 其中，上述方法步骤b所述的内胚层诱导阶段为将预处理后的hADSCs在含有ΙΟΟηΜ 的IDE1和3μΜ的CHIR99021的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时 间为24小时。 其中，上述方法步骤b所述成肝诱导阶段为将完成内胚层诱导后的细胞在含有浓 度为50~200nM IDE1、10~30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5~20μΜ LY294002和50 ~200nM LDN-193189的RPMI-1640培养基DMEM/F12培养基中诱导培养36~60小时；接着加 入含有浓度为50~200nM IDE1、10~30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5~20μΜ LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中继续进行诱导培养20~28小时。 其中，上述方法步骤b所述肝细胞的成熟阶段为将完成肝诱导阶段后的细胞在含 有150ng/mL的肝细胞生长因子(HGF)、20ng/mL的纤维母细胞生长因子4(FGF4)、30ng/mL的 抑瘤素 M(0SM)、2X ΙθΛιοΙ/L的地塞米松以及ITS预混通用培养添加物的Williams'E培养基 中诱导培养，培养时间114-140小时。其中，上述方法步骤a分离得到的hADSCs经培养3~7代后再按步骤b所述方法进行 诱导培养。 其中，上述方法所述的hADSCs在步骤b之前接种于I型胶原包被的培养皿中进行后 续诱导培养。 其中，上述方法所述hADSCs接种于I型胶原包被的培养皿中，当细胞长满培养皿底 部后按步骤b的进行诱导培养。同时，本专利技术还提供了使用上述方法由hADSCs诱导得到的iHeps细胞。本专利技术的优点在于:使用本专利技术的分化方法，仅需要十天左右的时间就能产生足 够的具有特异的形态、基因表达及功能的肝细胞，是目前用时最短的肝细胞分化方法。本发 明方法能获得由hADSCs来源的肝细胞，使来自患者的自体脂肪组织的细胞用于治疗肝病成 为可能，从而可以避免异体细胞的免疫排斥反应。其次，本专利技术方法的诱导过程快速而高 效，这将有利于临床治疗方案的及时应用。此外，根据诱导分化后的肝细胞的功能分析，使 用本专利技术方法诱导获得的细胞作为肝细胞的资源，将有助于肝细胞移植的发展。因此，该方 法为hADSCs在肝脏疾病细胞治疗中的应用迈出了重要的一步。【附图说明】图1为诱导培养后的细胞形态图片。图2为对诱导结束的细胞进行ELISA和RT-PCR检测结果。图3为肝细胞特异性基因表达的qPCR检测结果。图4为使用诱导得到的iHeps进行改善CC14诱导的急性肝损伤的功能试验结果。【具体实施方式】 本专利技术方法具体可按以下步骤实施： a、从人的离体脂肪组织中分离出hADSCs; b、体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下4个阶段： 预处理阶段:在步骤a分离得到的hADSCs中加入含有0.5~2μΜ的ATRA的RPMI-1640 培养基或DMEM/F12培养基，进行诱导培养，诱导时间为20~28小时； 内胚层诱导阶段:将预处理后的hADSCs在含有浓度为50~200ηΜ的IDE1、1~5μΜ 的CHIR99021和5~20μΜ的LY294002的RPMI-1640本文档来自技高网...
【技术保护点】
体外诱导hADSCs向iHeps分化的方法，其特征包括以下步骤：a、从人的离体脂肪组织中分离出hADSCs；b、体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下4个阶段：预处理阶段：在步骤a分离得到的hADSCs中加入含有0.5～2μM ATRA的RPMI‑1640培养基或DMEM/F12培养基，进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；内胚层诱导阶段：将预处理后的hADSCs在含有浓度为50～200nM IDE1、1～5μΜ CHIR99021和5～20μM LY294002的RPMI‑1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；成肝诱导阶段：完成内胚层诱导后的细胞在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002和50～200nM LDN‑193189的RPMI‑1640培养基或DMEM/F12培养基中诱导培养36～60小时；接着在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002的RPMI‑1640培养基或DMEM/F12培养基中继续进行诱导培养20～28小时；肝细胞的成熟阶段：完成了成肝诱导后的细胞在含有浓度为100～200ng/mL肝细胞生长因子(HGF)、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、20～40ng/mL抑瘤素M(OsM)、1.5～3×10‑5mol/L地塞米松(Dex)以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中进行成熟阶段的诱导培养，培养时间为112～144小时；得到由hADSCs分化而来的iHeps细胞。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓洪新，付艳丽，邓节，徐芬，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。