【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因治疗领域，主要涉及抑制cd47-sirpα信号轴基因表达的sirna、纳米粒子及其用途。
技术介绍
1、小核酸药物通过反义技术靶向rna可使特定疾病基因沉默，达到治疗目的。小核酸药物作为一种治疗策略，具有高特异性、高效性、长效性等优势，大大扩展了可用于治疗的靶点的数量和类型。安全高效的递送系统是小核酸药物研发的关键，而筛选出有效的靶点也是小核酸药物研发的重点。
2、1957年，burnet和thomas提出了“免疫监测”假说，认为免疫系统可以监测并消除“外来”病原体，包括表达各种肿瘤特异性抗原和非肿瘤特异性抗原的恶性细胞，以维持一个稳定的环境。肿瘤免疫监视是限制肿瘤生长的重要过程，巨噬细胞在肿瘤细胞的识别和清除过程中起着重要作用。t细胞和自然杀伤细胞(nk)也是免疫系统中重要的效应细胞，在抗肿瘤免疫中也起着关键作用。而肿瘤细胞逃避免疫识别和清除依赖于多种过程，包括诱导免疫抑制肿瘤微环境和降低肿瘤细胞免疫原性。
3、cd47(分化簇47，也称为整合素相关蛋白,integrin-associated protein)是一种具有糖基化的跨膜蛋白，cd47激活后可以介导细胞增殖、迁移、吞噬以及细胞凋亡，免疫稳态等一系列过程。肿瘤细胞免疫逃逸的一个关键机制是通过过度表达免疫抑制信号分子cd47。cd47被广泛认为是一种“不要吃我”的信号，它有助于在生理条件下维持非恶性细胞的免疫耐受性。但另一方面，这种分子却可以帮助不同癌症类型的癌细胞存活。癌细胞利用cd47的“不要吃我”的功能，在表面表达高于非恶
4、肿瘤细胞表面高表达cd47蛋白，而该蛋白与巨噬细胞表面的配体sirpα结合后会抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用从而使得肿瘤逃避免疫监视得以发生转移。研究表明sirpα是一种属于免疫球蛋白超家族的膜蛋白，主要由巨噬细胞和树突状细胞等髓系细胞表达，通过进一步阐明吞噬抑制的机制，研究人员发现巨噬细胞的sirpα会与邻近细胞上表达的cd47相互作用，导致sirpα胞浆免疫受体酪氨酸抑制基序磷酸化。这一过程会募集shp-1和shp-2磷酸酶，下游信号级联阻止肌球蛋白-iia在吞噬细胞突触聚集，导致吞噬抑制。实体肿瘤组织中存在大量的巨噬细胞，而这些巨噬细胞处于免疫抑制状态，促进了肿瘤的发生转移。因此靶向巨噬细胞中sirpα是抗肿瘤治疗中的潜在靶点。
5、目前，小核酸药物在实际应用过程中也效果有限，注射小核酸药物后，如何延长药物在体内的存留时间，如何靶向、精准的让治疗性的小核酸药物进入靶细胞发挥治疗功能等方面还面临很大的挑战。而且小核酸药物效果不及预期还可能是由于以下方面的差异：(1)sirna靶点选择及序列设计的挑战，如特异性、有效浓度、沉默效率、脱靶效应等；(2)药物输送方式(路径、载体、频率、效率)；(3)肿瘤细胞内的药物的区域化分布；(4)肿瘤异质性、肿瘤微环境的变化、药物失活、肿瘤细胞药物吸收减少或药物释放增加、肿瘤细胞存活途径的激活和表观遗传变化等等方面都由可能影响小核酸药物的实际使用情况。此外，小核酸药物尤其是rnai药物，分子到达作用位点需要穿过胞膜作用于胞浆或核内的mrna，递送难度大，尽管化学修饰能够解决稳定性和免疫原性的问题，但如果不能进入细胞实现胞吞，小核酸药物依然不能发挥药物作用。
6、dp7多肽(vqwrirvavirk)是用计算机辅助设计新型抗菌肽的筛选方法，通过对模板抗菌肽hh2替换了2个氨基酸得到的具有更高的细菌识别特异性与更强的抗菌活性的抗菌肽。抗菌肽纳米化可以使其获得较好稳定性及减少毒性，这为抗菌肽的应用提供一个新研究方向。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是为小核酸药物抗肿瘤药物提供一种新的有效选择。
2、为了解决上述的技术问题，本专利技术提供了抑制cd47-sirpα信号轴基因表达sirna。
3、本专利技术提供了一种抑制cd47-sirpα信号轴基因表达表达的sirna，所述sirna序列为抑制sirpα的sirna，其序列为：
4、sirpαsirna正义链(seq id no.1)：5’-ccgugaacccuaguggaaa-3’；
5、sirpαsirna反义链(seq id no.2)：5’-uuuccacuaggguucacgg-3’。
6、本专利技术还提供了另一种抑制cd47-sirpα信号轴基因表达的sirna，所述sirna序列为抑制cd47的sirna，其序列为：
7、cd47 sirna正义链(seq id no.3)：5’-ggaaugaccucuuucacca-3’；
8、cd47 sirna反义链(seq id no.4)：5’-uggugaaagaggucauucc-3’。
9、进一步的，上述的抑制cd47基因表达的sirna和抑制sirpα基因的sirna的正义链和反义链的3’端垂悬有dtdt。
10、在此基础上，本专利技术还提供了抑制cd47-sirpα信号轴基因表达的sirna组，其包括上述的抑制cd47基因表达的sirna和抑制sirpα基因的sirna。
11、本专利技术还提供了一种装载了上述的sirna的纳米粒子。该纳米粒子是由疏水化修饰的多肽装载上述的抑制cd47和sirpα基因表达的sirna制备而成；所述多肽的序列为vqwrirvavirk(seq id no.5)，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段。
12、其中，上述装载sirna的纳米粒子中所述的多肽vqwrirvavirk碳端酰胺化修饰为vqwrirvavirk-nh2。
13、其中，上述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或peg或peg衍生物；其中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为c6-c20中的至少一种。
14、其中，上述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的peg衍生物为1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种。
15、其中，上述多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-co-oh与多肽上的-nh2酰胺化反应生成。优选的，所述疏水化修饰的多肽结构为：
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1.抑制CD47-SIRPα信号轴基因表达表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA序列为抑制SIRPα的siRNA：
2.抑制CD47-SIRPα信号轴基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA序列为抑制CD47的siRNA：
3.根据权利要求1或2所述的抑制CD47-SIRPα信号轴基因表达的siRNA，其特征在于：所述的抑制CD47基因表达的siRNA和抑制SIRPα基因的siRNA的正义链和反义链的3’端垂悬有dTdT。
4.抑制CD47-SIRPα信号轴基因表达的siRNA组，其特征在于：包括权利要求1和2或者权利要求3所述抑制CD47基因表达的siRNA和抑制SIRPα基因的siRNA。
5.装载siRNA的胶束，其特征在于是由疏水化修饰的多肽装载权利要求1～3任一项所述的抑制CD47-SIRPα信号轴基因表达的siRNA，或者权利要求4所述的抑制CD47-SIRPα信号轴基因表达的siRNA组制备而成；所述多肽的序列为VQWRIRVAVIRK，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段。
6.根据
7.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或PEG或PEG衍生物；其中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为C6-C20中的至少一种。
8.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的PEG衍生物为1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇中的至少一种。
9.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的多肽的氮端与疏水片段偶联的方式为通过疏水片段上的-CO-OH与多肽上的-NH2酰胺化反应生成；优选的，所述疏水化修饰的多肽结构为：
10.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的多肽结构中的R为：
11.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于所述的疏水化修饰多肽和小核酸按质量比3～5︰1作为原料制备而成。
12.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于是由疏水化修饰多肽与siRNA共孵育制得。
13.根据权利要求3所述的装载siRNA的纳米粒子，其特征在于是由所述的疏水化修饰阳离子多肽与所述药物在水中、缓冲液或液态培养基中共孵育5～15min而得；优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种，液体培养基为RPMI 1640、DMEM双无培养基或Opti-MEM培养基中的至少一种。
14.权利要求1或2任一项所述的抑制CD47或SIRPα基因表达的siRNA或权利要求3～11任一项所述的装载siRNA的纳米粒子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
15.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、脑胶质瘤、胰腺癌、骨肉瘤、头颈部肿瘤等中的至少一种。
16.抗肿瘤药物，其特征在于由权利要求1～3任一项所述的抑抑制CD47-SIRPα信号轴基因表达的siRNA表、权利要求4所述的抑制CD47-SIRPα信号轴基因表达的siRNA组，或权利要求5～15任一项所述的装载siRNA的纳米粒子添加药学上可接受的成分制备而成。
...【技术特征摘要】
1.抑制cd47-sirpα信号轴基因表达表达的sirna，其特征在于，所述sirna序列为抑制sirpα的sirna：
2.抑制cd47-sirpα信号轴基因表达的sirna，其特征在于，所述sirna序列为抑制cd47的sirna：
3.根据权利要求1或2所述的抑制cd47-sirpα信号轴基因表达的sirna，其特征在于：所述的抑制cd47基因表达的sirna和抑制sirpα基因的sirna的正义链和反义链的3’端垂悬有dtdt。
4.抑制cd47-sirpα信号轴基因表达的sirna组，其特征在于：包括权利要求1和2或者权利要求3所述抑制cd47基因表达的sirna和抑制sirpα基因的sirna。
5.装载sirna的胶束，其特征在于是由疏水化修饰的多肽装载权利要求1～3任一项所述的抑制cd47-sirpα信号轴基因表达的sirna，或者权利要求4所述的抑制cd47-sirpα信号轴基因表达的sirna组制备而成；所述多肽的序列为vqwrirvavirk，所述的疏水化修饰为在多肽的氮末端偶联疏水片段。
6.根据权利要求3所述的装载sirna的纳米粒子，其特征在于所述的多肽vqwrirvavirk碳端酰胺化修饰为vqwrirvavirk-nh2。
7.根据权利要求3所述的装载sirna的纳米粒子，其特征在于所述疏水片段为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸或peg或peg衍生物；其中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物；或者所述饱和直链脂肪酸为c6-c20中的至少一种。
8.根据权利要求3所述的装载sirna的纳米粒子，其特征在于所述的甾醇类化合物为丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种；或者所述的peg衍生物为1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二...
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