一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用技术

本发明专利技术涉及细胞的分离培养方法及其应用，具体涉及一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用。它包括取人体脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行扩增培养，其中所述体外培养体系含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＥＦＧ和ＦＣＳ。本发明专利技术的脂肪间充质干细胞具有ＣＤ１１ａ↑［－］、ＣＤ３１↑［－］、ＣＤ３４↑［－］、ＣＤ４５↑［－］和ＨＬＡ－ＤＲ↑［－］，且ＣＤ４４↑［＋］或Ｆｌｋ－１↑［＋］的表型。本发明专利技术还公开了脂肪间充质干细胞新的医药用途，为组织工程、再生医学中的种子细胞来源以及为成体干细胞群的应用提供了新的选择。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞的分离培养方法及其应用，特别是涉及一种脂肪间充质干细胞的分离和体外扩增培养方法。
技术介绍
干细胞是一种具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。在个体发育过程中，存在各种形式的干细胞例如胚胎干细胞，能够分化成人体各种类型的细胞，多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞等。目前，已有利用干细胞治疗心肌梗塞、先天性骨发育不全、类风湿性关节炎、神经损伤的实验报道。成体干细胞是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，在特定环境下可诱导分化成多种组织细胞。脂肪来源的间充质干细胞就是一类亚全能干细胞群。早在20世纪60年代，Rodbell首次报道了分离脂肪细胞的方法1，包括将脂肪组织剪碎，胶原酶消化，梯度离心，来得到上层悬浮的成熟脂肪细胞，而血细胞、纤维母细胞、内皮细胞以及脂肪祖细胞等均位于细胞沉淀中。随后，许多研究者对这一方法进行了改进，将吸脂术所得组织作为脂肪组织的来源2-6。吸出的脂肪用无菌的PBS平衡盐溶液冲洗以去除血细胞和局麻药，然后用□型胶原酶消化，37℃，30分钟以去除细胞外基质，然后用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)完全培养基终止胶原酶的作用，1200g离心10分钟，去除上清，用含10％胎牛血清的DMEM重悬细胞沉淀，然后用0.16mol/l的NH4Cl溶解剩余的红细胞，离心洗涤后用含10％FBS的DMEM重悬细胞，接种后置入37□，5％CO2的培养箱中培养，12小时后用PBS冲洗，去除未贴壁的细胞，此后每三天半量换液，细胞达到80％融合时，用胰酶-EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)消化，传代7-12。培养的脂肪来源的MSCs呈纤维细胞样生长。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法和由此获得的脂肪间充质干细胞的新的医药用途。本专利技术的问世是基于这样一个发现具有CD11a-、CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD44+或Flk-1+的表型的脂肪间充质干细胞可诱导分化为造血细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞和上皮细胞。本专利技术的技术方案为一种脂肪间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，它包括取人体脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行扩增培养。所述体外培养体系含有DMEM/F12、EFG和FCS；较佳地，所述体外培养体系含有90％-99％DMEM/F12、10-30ng/mlEFG和1-10％FCS；优选含有95％DMEM/F12、5％FCS、20ng/mlEGF的培养体系。另一方面，本专利技术还提供了一种脂肪间充质干细胞，所述脂肪间充质干细胞具有CD11a-、CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD44+或Flk-1+的表型。所述脂肪间充质干细胞可由上述方法获得。更佳地，所述脂肪间充质干细胞还具有CD29+、CD105+和/或CD166+的表型。另一方面，本专利技术还提供了上述脂肪间充质干细胞在制备可诱导分化为造血细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、上皮细胞的药物中的用途。此外，本专利技术还提供了上述脂肪间充质干细胞在制备可用于人体其它组织工程、组织再生、修复的药物中的用途。本专利技术提供了一种脂肪间充质干细胞分离和体外扩增培养的方法，操作简单可行；本专利技术还公开了人脂肪来源的间充质干细胞新的医药用途。此类细胞经移植体内可分化为多种组织特异的细胞，参与机体多种组织的损伤修复，其优势在于脂肪取材方便，给患者带来的痛苦较小，而且不容易受到恶性肿瘤的侵犯，更容易进行体外净化，对恶性血液病和实体肿瘤的患者可以预先储备脂肪来源的干细胞亚群，在大剂量放疗和化疗后可以用于重建造血。这就为组织工程、再生医学中的种子细胞来源以及为成体干细胞群的应用提供了新的选择。附图说明图1脂肪间充质干细胞的形态学观察和瑞士染色图2脂肪间充质干细胞生长曲线图3脂肪间充质干细胞免疫表型流式细胞议结果图4脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化示钙化小结(a)实验组第四天 (b)实验组第八天 (c)对照组图5脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化油红-O染色(a)实验组为红色呈阳性 (b)对照组阴性图6脂肪间充质干细胞向神经细胞分化(a)诱导4小时后细胞形态 (b)NF阳性 (c)NSE阳性 (d)GFAP阴性图7脂肪干细胞亚群向内皮细胞分化(a)诱导14天后细胞形态 (b)实验组CD31阳性 (c)对照组CD31阴性(d)实验组vWF阳性 (e)对照组vWF阴性(f)Western blot证实vWF (g)免疫电镜证实vWF图8脂肪干细胞亚群向肝上皮样细胞分化 (a)诱导前细胞形态 (b)实验组ALB单抗绿色荧光 (c)ALB对照组(d)实验组CK18单抗红色荧光 (e)CK18对照组(f)b和d结合的ALB+CK18+ (g)RT-PCR验证ALB和CK18图9干细胞亚群参与受体小鼠血管的新生荧光显示鼠vWF蓝色，人vWF绿色，人CD45红色(A)小肠 (B)肝脏 (C)肺 (D)修复的创伤图10干细胞亚群参与受体小鼠呼吸道上皮细胞损伤的修复(A)支气管中人特异抗体pan-CK染色(B)小鼠支气管局部显示人pan-CK蓝色，人CD45红色，人Y-染色体DNA探针绿色(箭头指示)(C)RT-PCR证实支气管中有供体来源的上皮细胞(D)肺中人特异抗体SP-B染色(E)小鼠肺局部显示人SP-B蓝色，人CD45红色，人Y-染色体DNA探针绿色(箭头指示)(F)RT-PCR证实肺中有供体来源的上皮细胞(G)Western blot证实供体来源的上皮细胞图11干细胞亚群参与受体小鼠消化道上皮细胞损伤的修复(A)小肠中人特异抗体pan-CK染色(B)小鼠小肠局部显示人pan-CK蓝色，人CD45红色，人Y-染色体DNA探针绿色(箭头指示)(C)胃中人特异抗体pan-CK染色(D)小鼠胃局部显示人pan-CK蓝色，人CD45红色，人Y-染色体DNA探针绿色(箭头指示)(E)和(F)RT-PCR证实受体鼠内脏中有供体来源的上皮细胞图12干细胞亚群参与受体小鼠肝上皮细胞损伤的修复(A)人特异抗体ALB染色(B)小鼠肝脏局部显示人ALB蓝色，人CD45红色，人Y-染色体DNA探针绿色(箭头指示)(C)RT-PCR证实受体鼠肝脏中有供体来源的ALB+上皮细胞(D)Western blot证实有功能的供体来源肝上皮细胞具体实施方式本专利技术涉及一种脂肪间充质干细胞及其分离和体外扩增培养的方法及由该方法获得的脂肪间充质干细胞。本专利技术还涉及所述脂肪间充质干细胞在制备可诱导分化为造血细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、上皮细胞的药物中的用途。具体地说，本专利技术的方法可包括如下步骤取人脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行扩增培养，其中所述体外培养体系含有DMEM/F12、EFG和FCS；较佳地，所述体外培养体系含有90％-99％DMEM/F12、10-30ng/ml EFG和1-10％FCS；优选含有95％DMEM/F12、5％FCS20ng/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，它包括取人体脂肪组织，用胶原酶消化，经梯度离心、过滤，随后在体外培养体系中进行扩增培养；其特征在于，由该方法分离、培养获得的脂肪间充质干细胞具有ＣＤ１１ａ↑［－］、ＣＤ３１↑［－］、ＣＤ３４↑［－］、ＣＤ４５↑［－］和ＨＬＡ－ＤＲ↑［－］，且ＣＤ４４↑［＋］或Ｆｌｋ－１↑［＋］的表型；所述脂肪间充质干细胞经制备可分化为造血细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、上皮细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春华，
申请(专利权)人：赵春华，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]