本发明专利技术公开了一种人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用，人脂肪间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：脂肪的采集、脂肪的运输、脂肪的交接、制备脂肪微块、SVF提取、原代培养、传代培养、细胞冻存及建立细胞库、细胞复苏。人脂肪间充质干细胞具有强大的免疫调节作用，能应用在制备治疗自身免疫性疾病药物中，与常规药物相比具有如下有点：1、治疗方便，疗效持久。能帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物治疗带来的毒副作用，甚至停用免疫抑制剂等药物治疗，降低死亡率和致残率，改善生活质量；2、安全性好，无毒副反应；3、脂肪组织来源广泛，采集方便，且脂肪MSCs的基础研究扎实，制备技术成熟，可推广程度高，技术可控；4、人脂肪MSCs制备成本相对其他生物制剂费用低，多数患者能够接受。
【技术实现步骤摘要】
人脂肋间充质干细胞制备方法及其在制备疾病药物的应用
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种人脂肪间充质干细胞制备方法及其在制备 疾病药物的应用。
技术介绍
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是一类具有多向分化潜能、低免 疫原性的成体干细胞，具粘附性，呈纺键型、成纤维细胞样形态，在胚胎发育中来源于中胚 层，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞、 肌膊细胞等。MSCs广泛地存在于人体的骨髓、脂肪、牙周膜、新生儿的厮带、胎盘、羊膜、羊水 等组织中，来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持 多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，是一种非常理想的细 胞治疗和再生医学的种子细胞。 从细胞表型特征来看，目前并没有发现MSCs有某种特异性的细胞表型标记，而通 常认为MSCs不表达造血干细胞的表面标记如〔045八014八011，及一些共刺激分子如〔080、 CD86、CD40 和 CD31。一般认为 MSCs 表达 CD105、CD73、CD44、CD90、CD106、CD29 等。2006 年国际细胞治疗协会（the international society for cellular therapy, ISCT)间充质 组织干细胞委员会（Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee)对间充质干细胞的 最低标准做了规定：第一，MSCs必须是可W在塑料培养器皿中贴壁生长的细胞；第二，MSCs 流式检测必须> 95%表达CD105, CD73, CD90抗原，同时必须《2%表达CD45, CD34, CD14， CDUb，Cd79a和HLA II;第H，MSCs必须具备在体外诱导称为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细 胞的能力。因此，一般通过W上H点综合鉴定MSCs。 脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪MSCs,其生物学性质与骨 髓MSCs相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、膜岛和神经等多种细胞方向分 化。目前所报道的MSCs主要来源于骨髓，采用密度梯度离也法分离获得。相对于骨髓MSCs, 脂肪MSCs有一下优势： 1、脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富。且脂肪组织取材容易，吸脂手术属于技术 成熟的常规手术，手术风险小，患者痛苦少，该一点尤其利于临床应用； 2、脂肪MSCs获取效率要优于骨髓。细胞克隆形成实验表明，MSCs只占到成人骨 髓的（0.2?1) X 10-5。而脂肪组织经胶原酶消化后，其中主要的细胞类型脂肪细胞，很容 易通过浮力而去掉，所获得的细胞克隆形成率是骨髓MSCs的100?500倍； 3,从临床角度出发，在短时间内更容易获得大量的脂肪干细胞，对于急性也肌梗 塞等疾病的快速治疗具有重要意义。在局部麻醉的情况下，成人骨髓的获取量通常不超过 40ml，能获得大约1. 2X 109个有核细胞，其中包含大约2. 4X 104个MSCs。如果想获得更 多的骨髓，则需要全身麻醉，则增加了病人痛苦和发生并发症的风险；而一次吸脂手术可 获得超过200ml的脂肪组织，且每IOOml都能获得大约2 X 108个有核细胞，其中含有大约 1. 2X108的干细胞，相当于相同体积骨髓的2000倍。 [000引由此可见，在相同条件下，脂肪更具临床应用潜力。 由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因 治疗等方面都有着广阔的应用前景。2012年1月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物 化epistem(自体脂肪来源的MSCs)成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发化瘦。同年10 月，美国FDA批准了切tori化erapeutics公司脂肪干细胞对也脏衰竭患者有效性的临床 试验。脂肪MSCs已成为继骨髓MSCs后干细胞领域另一个备受关注的热点。 MSCs本身不表达II类主要组织相容性抗原及共刺激因子CD80、CD86或CD40,其 本身具有低免疫原性，然而，研究显示；MSCs却对主要免疫效应细胞包括T细胞，B细胞，NK 细胞的增殖和功能活性均有显著抑制作用，同时调节递呈细胞如DC细胞的活性，激活调节 性T细胞（T regulato巧cells)。MSCs对主要免疫效应细胞作用如下： 1、MSCs与T淋己细胞；多个实验室的研究结果表明MSCs在体内体外均对异体抗 原（alloantigens)，丝裂原（mitogens)和抗CD3, CD28抗体激活的T细胞的增殖具有显 著抑制作用。MSCs同样对记忆性T细胞和未成熟T细胞均有抑制作用。而且，MSCs不受 主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex)限制，异体MSCs同样可W 发挥抑制效果。在分子水平上，MSCs可W使活化的T细胞阻滞在G0/G1期，下调周期蛋白 cyclinD2的表达，上调p27的表达。MSCs对T细胞的抑制作用机理一般有两种；1)直接接 触；2)分泌细胞因子。T细胞细胞膜表面高表达化S，而MSCs表达其配体化Si, MSCs通过 分泌MCP-I将T细胞招募到其周围，通过化s/化Sl经典调亡通路促使T细胞调亡。同时调 亡的T细胞碎片被吞瞻细胞吞瞻后，刺激吞瞻细胞产生TGF-目，又促使未成熟T细胞分化为 CD4+CD25 hi曲forldiead box P3(Foxp3+)调节性T细胞，进一步抑制T细胞增殖和功能。 炎性因子如IFN-Y、IL-I目、TNF-a，可W促使MSCs分泌免疫抑制蛋白剛巧胺2, 3-双加氧 酶（indoleamine2, 3-dio;sygenase，ID0)，IDO能够降解色氨酸，并导致犬尿素，3-氨茵醜丙 氨酸化ynurenine)合成，进而抑制淋己细胞增殖；将MSCs与T细胞共培养后，促使MSCs分 泌前列腺素E2 (prostaglandi址2, PGE2)，使用阳G2的抑制剂可W逆转MSCs对T细胞增 殖的抑制作用。在炎性因子刺激下，MSCs胞内一氧化氮合成酶（in化Cible nitric oxide synthase, iNO巧表达升高，并分泌NO至胞外，NO可W抑制T细胞信号转到与转录激活蛋 白 5 的磯酸化（signal transducer and activator of transcription-5, STATS)，抑制 T 细胞的活化。在风湿动物模型实验中，研究者发现，MSCs可W抑制促炎细胞化1/化17细胞 扩增，降低炎性因子如IFN- Y和IL-17的分泌，同时促进化2细胞分泌抗炎因子如IL-4和 IL-IOo 2、MSCs与B淋己细胞；B细胞可W被抗CD-4化抗体或比-4或抗免疫球蛋白抗体 刺激后活化，而MSCs可W抑制活化B细胞的增殖。另外，MSCs可W抑制B细胞趋化因子受 体如CXCR4XXCR5和CCR7的表达，但不影响B细胞的共刺激分子和细胞因子的表达。MSCs 抑制B细胞增殖的具体分子机制尚不清晰，有研究称，MSCs通过直接接触和分泌ID0,抑制 B细胞的色本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于：它包括如下具体步骤：(1)脂肪的采集：经供体筛选合格后吸脂或手术切除方式无菌采集脂肪标本10ml以上；(2)脂肪的运输：将脂肪置于保存液中，2‑8℃恒温保存于疫苗箱中，48h内送至实验室；(3)脂肪的交接：实验室接收脂肪，登记好客户信息，并进行编码；(4)制备脂肪微块：洗涤脂肪，去除残留的血液，将脂肪绞碎为0.5‑1mm3的脂肪微块；(5)SVF提取：0.1％胶原酶I消化脂肪微块，离心弃去上层，100um滤网过滤，获得SVF；(6)原代培养：按照1×105个/ml接种，置于(37±0.5)℃，(5±0.2)％浓度C02条件，培养基为人间充质干细胞无血清完全培养基；(7)传代培养：原代培养经7d左右，细胞融合达70％～80％时，胰酶消化收集P0代细胞，按照5000～6000个/cm2的密度传P1，经3d，P1代融合达80％～90％时，同上，传P2，以此类推传至P3、P4......；(8)细胞冻存及建立细胞库：将上述获得的每批次人脂肪间充质干细胞进行无菌、支原体、内毒素、核型分析、流式表面标记等检测，检测合格的人脂肪间充质干细胞按照供体来源、细胞编码、细胞数量、细胞代数及冻存日期等进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，建立细胞库；(9)细胞复苏：将人脂肪间充质干细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得人脂肪间充质干细胞，按照需求使用即可。...
【技术特征摘要】
1. 一种人脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于：它包括如下具体步骤： (1)脂肪的采集：经供体筛选合格后吸脂或手术切除方式无菌采集脂肪标本l〇ml以 上； ⑵脂肪的运输：将脂肪置于保存液中，2-8°C恒温保存于疫苗箱中，48h内送至实验 室； (3)脂肪的交接：实验室接收脂肪，登记好客户信息，并进行编码； ⑷制备脂肪微块：洗涤脂肪，去除残留的血液，将脂肪绞碎为〇. 5-lmm3的脂肪微块； (5) SVF提取：0. 1 %胶原酶I消化脂肪微块，离心弃去上层，lOOum滤网过滤，获得SVF ; (6) 原代培养：按照IX 105个/ml接种，置于（37 ±0. 5) °C，（5 ±0. 2) %浓度C02条件， 培养基为人间充质干细胞无血清完全培养基； (7) 传代培养：原代培养经7d左右，细胞融合达70%?80%时，胰酶消化收集P0代细 胞，按照5000...
【专利技术属性】
技术研发人员：张炳强，
申请(专利权)人：张炳强，
类型：发明
国别省市：山东;37
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