一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法技术

本发明专利技术公开了一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，选择非酶消化法(TrypLE)收集贴壁的脂肪间充质干细胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度减少细胞消化过程中对细胞的损伤，并选择1.3×104/cm2最佳接种密度培养细胞，使用无血清培养基(UltraCULTURE MEDIUM)，并在培养基中加入合适浓度的EGF,在φ15cm的培养皿中进行大规模的培养。进而将脂肪间充质干细胞的传代次数提高至15代以上仍然能保持原来的干性。从而大大满足间充质干细胞在科学研究与应用上的需求。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法
本专利技术涉及一种细胞培养方法，具体地涉及一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法。
技术介绍
干细胞(stemcells)不同于成熟细胞首先是因为它能够在长时间内保持自我更新和扩增的能力，其次干细胞能够向多种细胞系分化。干细胞的这些特点使其成为良好的种子细胞来源。其中，间充质来源的成体多能干细胞(MSC)，具有取材方便体外培养容易的优点，已成为多种临床细胞疗法最可行的细胞来源之一。脂肪间充质干细胞(ADSC)是存在于脂肪组织中的干细胞，具有多向分化的潜能。2001年，脂肪间充质干细胞首次从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离获得，与骨髓等的间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞来源更丰富易得，这使其已成为组织工程中种子细胞研究的热点。脂肪间充质干细胞传代培养多采用低糖培养基L-DMEM，混合培养基DMEMF-12，培养液中添加双抗，采用较高的接种密度，细胞融合仍需要约5到7天时间。细胞状态增殖能力最佳的代次一般在P3代。最新研究显示，从脂肪组织中可以分离、培养得到间充质干细胞，通过鉴定其生物特征，可知其具有很强的增殖分化能力，免疫原性低。目前脂肪间充质干细胞的分离与传代大规模培养中，在细胞传代过程中使用胰酶进行细胞消化，对细胞损伤太大，导致传代细胞容易衰老死亡。使用含血清培养基培养影响细胞培养的稳定性。而接种密度按照1：3～1：5来接种细胞，在大规模培养及传代中，这会增加工作量，无法一次收集大量均一的细胞。目前传统的传代技术将脂肪干细胞的应用代数限制在6代以内，大大的限制了脂肪干细胞的应用。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的不足，本专利技术结合非酶消化法(TrypLE)，去除了酶解对于细胞的损伤作用，选择最佳的传代接种密度，使用无血清培养基，并在其中添加合适的生长因子，进而将脂肪间充质干细胞的传代次数提高至15代以上仍然能保持原来的干性。从而大大满足间充质干细胞在科学研究与应用上的需求。本专利技术目的通过以下技术方案来实现：一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，包括以下步骤：1)待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80-90％，吸去细胞培养皿中培养液，向每个培养皿内加PBS进行清洗后，吸去培养皿中的PBS；2)消化：在培养皿加入tryplE，转移至CO2培养箱孵育1-2min后，加入无血清培养基，用巴氏吸管反复吹打10-15次，待80-90％的细胞不再贴壁，终止消化；3)离心：将步骤2得到的细胞悬液转移至离心管中，1000rpm/min离心5min；4)计数：离心结束后，弃去上清液，用无血清培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，取20μl细胞悬液用细胞计数仪计数；5)铺板及培养：将细胞悬液接种到细胞培养皿中，调整细胞密度为1.3×104个/cm2,加入无血清培养基，无血清培养基中添加EGF，EGF的浓度为10ng/ml，转移至CO2细胞培养箱中进行培养。步骤1)所述PBS是沿着培养皿壁加入，不得直接冲洗培养皿底部；步骤1)所述清洗是加入PBS后培养皿要前后、左右晃动大于10次。步骤2)所述tryplE的用量为培养基总体积一半以内，最低用量为达到覆盖培养皿底部。所述tryplE的用量为在φ10cm培养皿中加入2ml的tryplE或者在φ15cm培养皿中加入3ml的tryplE。步骤2)所述无血清培养基的用量等于或者大于(tryplE)用量。步骤2)所述无血清培养基的用量为在φ10cm的培养皿中加入3ml的无血清培养基或者在φ15cm的培养皿中加入5ml的无血清培养基。无血清培养基为UltraCULTUREMEDIUM(Lonza)。步骤4)所述无血清培养基的用量为5ml。步骤4)所述细胞悬液计数前首先与0.4％的台盼蓝染色液按照1：1混合，染色后1h内计数。在步骤2)，镜下观察细胞消化情况，待80-90％细胞不再贴壁，可以进行终止消化。步骤5)所述无血清培养基的加入量为10ml或者15ml。现有技术传代过程中存在的缺点：(1)胰酶：传代过程中使用0.5％-0.125％胰酶消化细胞，通常不能准确根据细胞生长活力状态来选择胰酶浓度及作用时间(1min-5min)，常会超过一定程度而导致细胞传代后不能贴壁或者死亡，对细胞损伤过大，细胞增殖力下降。当细胞连续传代多次，则会出现细胞老化死亡现象。(2)接种密度：按照1：3～1：5的细胞密度接种细胞，满足小规模的细胞培养，在操作中可行，而在大规模细胞培养中，无法准确确定细胞密度，细胞生长无法同步，细胞传代时间不统一，增加工作量，无法大量收集同一批次细胞。(3)含血清培养基:血清对细胞的具有潜在毒性作用和血清源性污染。本专利技术在细胞传代培养中，选择非酶消化法(TrypLE)收集贴壁的脂肪间充质干细胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度减少细胞消化过程中对细胞的损伤，并选择1.3×104个/cm2最佳接种密度培养细胞，使用无血清培养基(UltraCULTUREMEDIUM)，并在培养基中加入合适浓度的EGF(10ng/ml),在φ15cm的培养皿中进行大规模的培养。与现有技术相比，本专利技术具有的优点及有益效果：(1)本专利技术培养细胞形态良好，呈现梭形，簇团性生长趋势。(2)本专利技术培养的细胞活性高,细胞经细胞计数仪鉴定，细胞活力达到90％以上，符合细胞传代及储存条件。(3)本专利技术培养的细胞增殖快，收获细胞数量大。2.5～3.5天即可长至80～90％。细胞培养皿收获的细胞总数可到3～4×106,细胞培养皿收获细胞可达6～8×106.(4)脂肪干细胞能够长期进行传代，15代之后仍然保持完整的干性，不出现衰老迹象。为了实现(1)、(2)优点，本专利技术在细胞传代培养中，选择非酶消化法(TrypLE)收集贴壁的脂肪间充质干细胞，使用最低的TrypLE用量，最大程度减少细胞消化过程中对细胞的损伤。为了实现(3)、(4)优点，本专利技术选择1.3×104个/cm2的最佳接种密度培养细胞，在φ10cm(或φ15cm)的培养皿中进行大规模的培养，并在无血清培养基中添加合适浓度(10ng/ml)的EGF。附图说明图1为传统法与无酶法细胞形态对比；A为传统法第1代、第6代MSCs细胞(100×)；B为无酶法第1、6、15代MSCs细胞(100×)；图2传统法与无酶法细胞增殖曲线；图3为第1代细胞表面标记物流式检测结果；图4为第6代细胞表面标记物流式检测结果；图5为第15代细胞表面标记物流式检测结果；图6为第15代细胞成脂分化；图7为脂肪间充质干细胞成骨诱导后细胞形态变化(×100)。图8为不同接种密度增殖曲线图。具体实施方式术语解释：胰酶：0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA(是质量/体积百分数)PBS:磷酸缓冲液EGF:上皮生长因子ADMSC:脂肪间充质干细胞IBMX：3-异丁基-1-甲基化黄嘌呤实施例1待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80％，用移液管吸去φ10cm细胞培养皿中培养液，加入10mlPBS清洗2次，加入2mlTrypLE消化贴壁细胞，镜下观察细胞消化情况，待细胞基本不再贴壁后，加入3ml无血清培养基(UltraCULTUREMEDIUM)终止消化，细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm/min离心5min，去上清液，用10ml无血清培养基重悬细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80‑90％，吸去细胞培养皿中培养液，向每个培养皿内加PBS进行清洗后，吸去培养皿中的PBS；2)消化：在培养皿加入tryplE，转移至CO2培养箱孵育1‑2min后，加入无血清培养基，用巴氏吸管反复吹打10‑15次，待80‑90％的细胞不再贴壁，终止消化；3)离心：将步骤2得到细胞悬液转移至离心管中，1000rpm/min离心5min；4)计数：离心结束后，弃去上清液，用无血清培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，得到细胞悬液，取20μl用细胞计数仪计数；5)铺板及培养：将步骤(4)的细胞悬液接种到无血清培养基中，调整细胞密度为1.3×104/cm2,加入无血清培养基，无血清培养基中添加EGF，EGF的浓度为10ng/ml；转移至CO2细胞培养箱中进行培养。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)待原代培养分离后的脂肪间充质干细胞融合度达到80-90％，吸去细胞培养皿中培养液，向每个培养皿内加PBS进行清洗后，吸去培养皿中的PBS；2)消化：在培养皿加入tryplE，转移至CO2培养箱孵育1-2min后，加入无血清培养基，用巴氏吸管反复吹打10-15次，待80-90％的细胞不再贴壁，终止消化；3)离心：将步骤2)得到的细胞悬液转移至离心管中，1000rpm/min离心5min；4)计数：离心结束后，弃去上清液，用无血清培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀，得到细胞悬液，取20μl用细胞计数仪计数；5)铺板及培养：将步骤4)的细胞悬液接种到无血清培养基中，调整细胞密度为1.3×104个/cm2，加入无血清培养基，无血清培养基中添加EGF，EGF的浓度为10ng/ml，转移至CO2细胞培养箱中进行培养；其中，所述步骤2)中tryplE的用量为在φ10cm培养皿加入的2ml的tryplE或者在φ15cm培养皿加入3ml的tryplE，且所述步骤2)中无血清培养基的用量大于或等于tryp...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，陈海佳，葛啸虎，卢瑞珊，马岩岩，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44