本发明专利技术公开了Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用。本发明专利技术提供了敲除动物Wip1的物质在制备具有如下(1)-(4)中至少一种功能的产品中的应用：(1)促进动物BMMSCs迁移；(2)抑制动物BMMSCs增殖；(3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞；(4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰。本发明专利技术实验证明，小鼠敲除Wip1后可以促进BMMSCs的迁移能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及Wipl(wild-typep53_induced phosphatase)敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞（BoneMarrowMesenchymalStem Cells，BMMSCs)迀移中的应用。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新， 并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细 胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。间充质干细胞（MesenchymalStemCells，MSCs) 是干细胞的一个研宄分支，其具有自我更新，多向分化，免疫调节及寻靶等一系列优势，为 将来细胞治疗呈现出希望。BMMSCs来源于骨髓，可在体外培养扩增，并能在体外特定条件下 能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经元细胞等；同时具有迀移能力和免 疫调节功能，能有效的用于多功能的治疗。 目前，关于MSCs用于治疗十余种难治性疾病的研宄已开始进行，其除了用来促进 恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病，肝 硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫 性疾病的治疗研宄，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。 然而自体MSCs的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如个体间MSCs扩增能力差 异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要，其中 MSCs和其他原代细胞一样在体外培养过程中具有生长停滞，过早衰老等相似的情况。这些 制约了自体MSCs的使用。涉及到MSCs迀移到靶位置和生长停滞的一些调控因子及机制研 宄的不够深入，报道的较少。因此，深入解析MSCs增殖和迀移信号转导途径网络，探讨如何 增强MSCs向受损组织趋化和迀移的能力，可以为提高MSCs移植效率和应用提供新思路和 理论依据。 细胞在增殖和迀移过程中都涉及到蛋白的磷酸化过程，Wipl是丝氨酸/苏氨酸磷 酸酶，由PPM1D基因编码。其主要表达于细胞核内，参与多条通路关键元件磷酸化/去磷酸 化的过程。目前研宄报道中，未见其参与MSCs迀移的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供敲除动物Wipl基因的物质的应用。 本专利技术提供的敲除动物Wipl基因在制备具有如下（1)_(4)中至少一种功能的产 品中的应用： (1)促进动物BMMSCs迀移； ⑵抑制动物BMMSCs增殖； (3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞； (4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰； Wipl基因的核苷酸序列为序列表中序列1。 上述应用中，所述促进动物BMMSCs迀移体现在提高动物BMMSCs的Racl活性、促 进PI3K/AKT表达和/或促进动物BMMSCs丝状伪足的形成； 所述使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞体现在抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。 上述应用中，所述动物为小鼠。 上述应用中，所述产品为药物。 本专利技术另一个目的是提供敲除动物Wipl基因的物质的另一种应用。 本专利技术提供的提供敲除动物Wipl基因的物质在制备具有如下A-D中至少一种功 能的产品中的应用： A、提高动物BMMSCs中Racl活性； B、促进PI3K/AKT表达； C、促进动物BMMSCs丝状伪足的形成； D、抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。 上述应用中，所述动物为小鼠。 上述应用中，所述产品为药物。 本专利技术实验证明，利用原代Wipr/_小鼠提取出来的原代BMMSCs经过细胞形态学 观察，分化能力鉴定，细胞表面特异标记识别鉴定，证明Wipl敲除可以促进小鼠BMMSCs迀 移。传统研宄方法利用以构建好的MSCs细胞系，在其基础上过表达或者干扰某基因来研宄 MSCs增殖停滞和迀移的分子机制。而本专利技术是利用敲除某基因的原代MSCs进行分子机制 研宄，相对传统而言，能做到既能完全排除细胞系本身所具备无限增长的影响，又能排除未 彻底清除某基因所保留部分生物学功能对机理研宄的影响。 本专利技术所涉及的研宄手段包括：增殖检测，细胞周期检测，相关蛋白表达水平检测 (westernblot，免疫焚光），细胞核染，形态学观察，细胞划痕实验，transwell检测，相关蛋 白活性检测，涉及信号通路研宄（抑制剂，westernblot)，F-actin染色，激光共聚焦检测。 这些方法具有更加科学，严谨，可信度高的特点。【附图说明】 图1为PCR鉴定Wipl+鼠的凝胶电泳分析。 图2为培养BMMSCs免疫表型和分化潜能的鉴定。 图3为敲除Wipl使原代BMMSCs停滞于G2期。 图4为敲除Wipl基因后降低cyclinBl蛋白表达。 图5为Wipl-/-BMMSCs表现出生长停滞和早衰。 图6为Wipl敲除后促进MSCs迀移愈合划痕。 图7为Wipl敲除后促进MSCs通过transwell膜。 图8为敲除Wipl后促进MSCs表达Racl活性。 图9为敲除Wipl后促进MSCs表达AKT及促进AKT的磷酸化，从而增加MSCs迀移 能力。 图10为Wipl敲除后促进MSCs肌动蛋白丝的重排及丝状伪足的形成。【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 Wipl+/-小鼠（遗传背景：C57BL/6,与该遗传背景相比，仅Wipl基因为杂合型，一 条染色体有Wipl，另一条染色体上敲除Wipl;其余基因与C57BL/6 -致，为全身性敲除小 鼠）：中国医学科学院医学实验动物研宄所，Wipl基因的核苷酸序列为序列表中序列1。 DNA组织样提取试剂盒：百泰克。 Racl-GTP Elisa试剂盒：Cytoskeleton, Inc.FITC-CD34,FITC-CD45,APC-CD44,APC-CD29andPE-CD90 及同型对照： e-Bioscience和MACS公司。抗体Wipl(D4F7)，AKT,p-AKT(Ser473)，p-AKT(Thr308)，cyclinBl(4138p)，andGAPDH(14C10):CellSignalingTechnology公司。 5umtranswell膜和 60_mm培养皿：Costar公司 油红、茜素红、DAPI染液：Sigma公司。 罗丹明-鬼笔环肽：LifeTechnologies公司。CellCountingKit_8 试剂盒：Dojingdo公司。 基础培养基、血清、成骨、成脂分化试剂盒：Gibco公司 NSC23766、LY294002 :R&D公司。CycleTESTPLUSDNA试剂盒：BDBiosciences公司。 实施例l、Wipl_~j、鼠的鉴定及原代小鼠BMMSCs提取、鉴定-、Wipl-A及Wipl-WT小鼠鉴定 将Wipl+小鼠杂交，所产后代10周后剪尾、编号，提取DNA，经PCR鉴定扩增的带 型，所用引物如下： 鉴定引物如下：【主权项】1. 敲除动物Wipl基因的物质在制备具有如下（1)-(4)中至少一种功能的产品中的应 用： (1) 促进动物BMMSCs迀移； (2) 抑制动物BMMSCs增殖本文档来自技高网...
【技术保护点】
敲除动物Wip1基因的物质在制备具有如下(1)‑(4)中至少一种功能的产品中的应用：(1)促进动物BMMSCs迁移；(2)抑制动物BMMSCs增殖；(3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞；(4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰；Wip1基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：牟玉莲，李奎，唐懿挺，刘岚，高倩，魏景亮，刘洋，黄雷，夏颖，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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