用于细胞特异和发育特异性选择分化的胚干细胞、成人干细胞和胚种系细胞的系统技术方案

本发明专利技术涉及一种系统，其利用抗性基因和可检测报道基因的组合在细胞特异和／或发育特异的启动子的共同控制之下，以细胞特异和发育特异的方式选择分化的胚干细胞、成人干细胞或胚种系细胞。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组的胚干细胞、胚种系细胞和成人的干细胞，其中含有非细胞损伤的可检测蛋白质的基因和抗性基因，制备细胞的方法以及其他实施方案。建议将培养物中的分化的胚干细胞(ES)的体外的心肌发生作为未限制的心肌细胞的来源，用于在不可逆受损的心脏组织替代治疗中进行移植(Klug等，1996)。这一途径实际进行时的一个主要障碍是分化的ES起源的心肌细胞的产量相对较低，它们通常只构成了不超过1-3％的分化的全部的ES-细胞群体(Muller M.等，2000)。另外，仍然存在的非分化的ES-供体细胞在与肿瘤发展相关的分化的后期中增加了受体的潜在危险。所以，开发有效的和高度特异的选择方法的目的认为是在心脏紊乱的细胞治疗中的里程碑。较早的时候已经证明，可以成功地从遗传修饰的ES-细胞中选择富含心肌细胞的群体，这些ES细胞是用受α-心脏-肌球蛋白-重链启动子控制的氨基糖苷磷酸转移酶(α-MHC-Neo)的药物抗性基因的转基因稳定转染的(Klug等，1996)。这一工作进一步显示了这一途径发展成大规模的有效方法的潜在问题a)在分化的ES细胞的贴壁培养物中进行了用选择药物(G418)来处理，而从有效性以及技术可行性的观点来看，最佳的途径是在ES-细胞-胚状体(胚状体＝EB)的聚集体的悬浮液上直接应用选择药物(Wobus等，1991)。b)通过工作证明在没有供体细胞的存活标记时导入的后果，显然使得有关在受体动物的心脏中导入遗传选择细胞的进一步实验更为复杂。DE-A-19727962叙述了非人哺乳动物的胚胎干细胞，是用含有DNA序列的DNA构建体来稳定转染的，该DNA序列编码了非细胞损伤的荧光蛋白质，其中所述DNA序列是在细胞和/或发育依赖的启动子的控制之下(Kolossov等，1998)。这样的重组ES-细胞具有下面的优点1.虽然用这一方法可以在体外提供特异的细胞类型，然而纯化这些重要的染色的细胞是困难的。一方面，这可以通过目的细胞(如心肌细胞)的数目仅占EB中产生的细胞约1-3％的事实来解释。另一方面，细胞纯化的方法(例如荧光活化细胞的分类，FACS)理想地是适于免疫细胞的。但是，在纯化例如心肌细胞时，许多细胞死亡或不可逆地损伤。2.另外，结果证明，在平铺的EB上，用潮霉素纯化方法，非潮霉素抗性细胞甚至在选择的7-14天后也难于除去。尽管预先利用了潮霉素作为选择标记，还是发生了肿瘤。这在用新霉素选择时是同样的。本专利技术的目的是提供从胚干细胞、胚种系细胞和成人干细胞的分化的培养物中分别选择和萃取细胞的新系统，从而避免了上面提到的问题。如本专利技术所述，作为“系统”，选择方法、细胞和细胞的利用以及尤其医学领域中的方法的组合还有待于理解。这一目的是通过权利要求1所述的胚干细胞、胚种系细胞和成人干细胞来达到的。本专利技术的优选的实施方案描述在权利要求1后的权利要求中。本专利技术公开了一种系统，其在细胞和/或发育特异的启动子的共同控制下，通过(药物)抗性基因和可检测的报道基因的结合应用，用于细胞和/或发育特异性选择分化的胚干细胞、胚种系细胞和成人干细胞。本专利技术首先一般性地，随后通过从用两种载体转染的胚干细胞的分化培养物中遗传选择心脏细胞的实施例进行了说明。需强调的是，本专利技术不局限于这些特定的实施方案，但可适用于所有3种胚层起源的细胞类型，即内胚层、中胚层和内胚层，和由于干细胞和种系细胞的多能性分别从中起源的细胞。本领域的技术人员能够在根据下面的叙述和常识，在所附的权利要求的范围内改变本专利技术。根据本专利技术，将至少一种抗性基因和至少一种编码例如非细胞损伤的可检测蛋白质的可检测的报道基因的信息导入胚干细胞、胚种系细胞和成人干细胞。两种基因的信息可以在一种载体上或分布在两种载体上获得。关键是可检测的例如荧光蛋白质的基因以及抗性基因的表达在同一个启动子的控制之下。根据本专利技术，启动子是从细胞特异的启动子和发育特异的启动子中选择的。细胞和组织特异的启动子分别指那些在特异的细胞群体和组织中有活性的那些启动子。所以，它们属于例如神经元细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑肌组织细胞以及角质细胞。特别优选的是心肌细胞(心肌细胞)。组织特异启动子的其他实施例是，在神经胶质细胞、造血细胞、神经元细胞，优选胚神经元细胞、内皮细胞、软骨细胞和表皮细胞以及胰岛素分泌β细胞中有活性的那些启动子。“组织特异”归类在术语“细胞特异”下。心脏特异启动子的例子有Nkx-2.5(分别特异于非常早期的心肌细胞和中胚层前体细胞(Lints等，1993))；人-心脏-α-肌动蛋白(特异于心脏组织(Sartorelli等，1990))；MLC-2V(特异于心室心肌细胞(O’Brien等，1993)和WO-A-96/16163)。非心脏特异启动子的其他实施例有PECAM1、FLK-1(内皮)、巢蛋白(nestine)(神经元前体细胞)、酪氨酸-羟化酶-1-启动子(多巴胺能神经元)、平滑肌α-肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白(平滑肌)、α1-胎蛋白(内胚)、平滑肌重链(SMHC最小启动子(特异于平滑肌(Kall-meier等，1995)。术语发育特异的启动子指，在发育过程的某些时间点中有活性的启动子。这些启动子的例子有β-MHC启动子，其在小鼠心室(Nentriculum)的胚发育过程中表达，并且在出生前的时期中用α-MHC启动子替代；NKx2.5，在早中胚层/心脏发育过程中的启动子；心钠素，除了起博点也是在后发育期下调的早期胚心脏的标记；F1k-1，在早期血管发生过程中有活性的内皮特异的启动子；在神经元前体细胞(胚胎神经元和胶质细胞)和成人胶质细胞(部分仍然能够分裂)中表达的nestine基因的内含子2-区段(Lothian和Lendahl，1997)。根据本专利技术，启动子涉及控制基因转录的DNA序列区。在一个实施方案中，它至少包括一个最小的序列，该序列定位于起始密码子的上游，并且包括转录起始的RNA聚合酶的结合位点。这一最小序列可以用其他功能DNA部分，特别是增强子来补充。同样可适用的是定位于内含子区并且可能定位于待转录基因的下游的调节元件。在这种情况中，转录速度例如可以通过本身不具有活性的其他增强子元件来控制。也可以利用启动子构建体，其中一个本身非组成型的活性元件(热休克蛋白质增强子)是与起源于内含子的基因的增强子区段一起利用的。在本专利技术的其他实施方案中，利用了允许选择，例如中胚层细胞的发育特异的启动子。控制抗性基因和可检测蛋白质的基因转录的可适用的启动子元件是NKx2.5、ANF和brachyuria启动子。在检测了表达可检测蛋白质的细胞后，例如，如果利用中胚层特异的启动子，则检测的细胞可以是中胚层细胞，加入适于抗性基因的选择试剂，选择中胚层前体细胞。通过转录受到共同启动子控制的可检测蛋白质的基因和抗性基因后，以高度特异的方式可以消除非分化细胞，例如胚多能性干细胞，从而可以相当大地减少肿瘤后来发展的可能性。这样得到的中胚层细胞可以移植进各个组织并且进一步在那里分化，例如移植后在预先受损的心脏区域中分化成心脏细胞。一方面，这一途径允许产生大量的预先纯化的前体细胞，另一方面，这一途径允许进一步移植后在天然条件下进一步分化。以相似的方法，通过内胚层或外胚层特异的启动子选择内胚层或外胚层细胞是本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有携带至少一种报道基因和至少一种抗性基因信息的ＤＮＡ序列的胚干细胞、胚种系细胞和／或成人干细胞，其中ＤＮＡ序列都在相同启动子的控制下，所述启动子选自至少一个细胞特异和／或发育特异的启动子，并且可操作地与所述基因连接，以及其中ＤＮＡ序列存在于至少一种或两种载体构建体上。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：贝恩德弗莱施曼，黑里贝特波伦，于尔根黑施勒，欧根科洛索夫，
申请(专利权)人：爱克西欧詹妮西斯公开股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]