人乳腺癌细胞特异性结合的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及人乳腺癌细胞特异性结合的多肽及其应用，所涉及多肽的氨基酸序列为：HPLGPTWRIPDT。所涉及的应用为本发明专利技术的人乳腺癌细胞MCF-7特异性结合的多肽特异结合人乳腺癌的应用。本发明专利技术筛选和初步鉴定获得的乳腺癌靶向多肽具有明显的乳腺癌细胞结合特异性，可用于研发乳腺癌早期靶向诊断试剂、高效低毒靶向治疗药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，以改良的肽库消减筛选法筛选对人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)特异性结合的多肽(序列)，对人乳腺癌细胞具有良好的结合特异性和敏感性。技术背景乳腺癌(breastcancer)是女性排名第一的恶性肿瘤，占女性新发恶性肿瘤的30％，严重危害着妇女健康。据国际癌症研究中心统计，全球每年约有46万女性因乳腺癌死亡，约占所有女性恶性肿瘤死亡的13.7％。近年来在我国特别是在一些大城市及沿海经济发展较快的地区，乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。目前，针对乳腺癌的主要治疗方法是影像检查、肿瘤标志物检测以及穿刺活检等，但是这些方法也可能会引起癌细胞扩散，产生创伤等问题。目前已有的一些肿瘤标志物大部分是乳腺癌血清肿瘤标志物，但是这些标志物大都特异性和灵敏度较低，治疗效果不明显。所以，尽快寻找一些新的乳腺肿瘤标志物也是当前研究的热点，而其中的关键元件是对癌细胞、癌组织具有特异靶向结合活性的分子片段的获得。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供以改良的肽库消减筛选由噬菌体12肽库筛选得到对乳腺癌细胞特异性结合的多肽序列，并提供鉴定该多肽与乳腺癌细胞特异性亲和力的实验结果，证明该多肽在乳腺癌的早期分子影像学诊断、靶向化疗、与其它材料偶联而进行的乳腺癌靶向治疗等方面具有的巨大应用价值。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：乳腺癌MCF-7细胞特异性结合的多肽，其氨基酸序列为：HPLGPTWRIPDT。该多肽能够特异性结合MCF-7细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞(即正常细胞)，并对其他肿瘤细胞表现出极低的亲和力或者无亲和力。上述乳腺癌MCF-7细胞特异性结合的多肽的筛选方法为以体外培养的MCF-7细胞系为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞系为非特异性吸附细胞，对噬菌体随机12肽库进行4轮消减筛选，随机挑取60个噬菌体克隆，利用ELISA鉴定阳性克隆。对阳性克隆进行DNA测序，分析其多肽的氨基酸序列组成及基本特征，最后获得拥有共有序列(Consensussequence)的强阳性克隆组3个，对它们以细胞免疫荧光法进一步鉴定其特异性和敏感性，确定最佳序列。各种噬菌体克隆水平、最佳序列合成肽探针水平的实验结果均提示序列HPLGPTWRIPDT特异性、敏感性最佳，这为该多肽未来用于乳腺癌的早期分子影像学诊断、靶向化疗、与其它材料偶联而进行的乳腺癌靶向治疗等提供了实验依据。本专利技术以乳腺癌MCF-7细胞为靶细胞，对噬菌体12肽库以我们改良的消减筛选法进行了4轮消减筛选，最后获得3条共同多肽序列，分别为HPLGPTWRIPDT、NSQARRHSSIDT、ANIDSSHHGNQP。通过一系列鉴定分析实验发现其中的HPLGPTWRIPDT对于乳腺癌的靶向性最强，提示了其用于乳腺癌诊断、靶向治疗方面的价值。在乳腺癌检测方面，利用同位素或者荧光标记的多肽可以特异性结合乳腺癌细胞/组织，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，对于乳腺癌早期检测、癌病灶定位和疗效评价都具有重要意义；在乳腺癌靶向治疗方面，有望利用其特异性高、分子量小、穿透力强、亲和力高的特性来与传统化疗药物(如顺铂、阿霉素等)偶联，达到靶向递送给药的目的，可大大减小化疗药物的非特异性和毒副作用。附图说明图1为本专利技术多肽的制备路线图；图2为随机十二肽pIII融合蛋白的N末端序列；图3为专用密码子表；图4为60个噬菌体克隆与MCF-7细胞亲和力两次ELISA鉴定结果；图5为三条共有序列的代表性阳性噬菌体克隆与细胞亲和力的免疫荧光鉴定，其中：A、C、E分别为：噬菌体克隆Q35、Q3、Q41与细胞MCF-7的亲和力；B、D、F分别为：噬菌体克隆Q35、Q3、Q41与细胞HEK293的亲和力；G、H分别为：PBS、URPs与细胞MCF-7的亲和力；图6为克隆Q35(HPLGPTWRIPDT)与其它肿瘤细胞亲和力鉴定，其中：A：MCF-7；B：SiHa(宫颈癌细胞)；C：Caco2(结直肠癌细胞)；D：SGC-7901(胃癌细胞)；E：SMMC-7721(肝癌细胞)；F：Eca-109(食道癌细胞)；图7为多肽(HPLGPTWRIPDT)与细胞特异性结合的剂量效应，其中：A、B、C、D、E为多肽与乳腺癌细胞MCF-7结合；F、G、H、I、J为多肽与人胚肾细胞HEK293结合，两组浓度分别为10μM、15μM、20μM、25μM、30μM；图8为多肽(HPLGPTWRIPDT)与细胞特异性结合的时间效应，其中：A、B、C、D、E为多肽与乳腺癌细胞MCF-7结合；F、G、H、I、J为多肽与人胚肾细胞HEK293结合，两组孵育时间分别为10min、20min、40min、60min、80min；图9为多肽(HPLGPTWRIPDT)与乳腺癌细胞的结合部位，其中：A、C：FITC-阳性多肽与MCF-7、HEK293细胞；B、D：FITC-阴性多肽与MCF-7、HEK293细胞；图10为多肽(HPLGPTWRIPDT)与其它肿瘤细胞的结合特异性，其中：A：SiHa(宫颈癌细胞)；B：SKV3(卵巢癌细胞)；C：Caco2(结直肠癌细胞)；D：SGC-7901(胃癌细胞)；E：SMMC-7721(肝癌细胞)；F：Eca-109(食道癌细胞)；图11为流式细胞仪检测多肽(HPLGPTWRIPDT)的结合特异性，其中：A：乳腺癌MCF-7细胞；B：HEK293细胞。绿色：FITC-BrcaProbe；红色：FITC-CtrlProbe；黑色：PBS；图12为多肽(HPLGPTWRIPDT)竞争抑制：多肽(HPLGPTWRIPDT)孵育靶细胞后，再以噬菌体克隆Q35孵育靶细胞，洗涤后根据噬菌体发出荧光的强弱分析多肽的特异性结合力。该竞争抑制力与多肽浓度正相关，说明多肽特异性良好。以下结合附图和具体实例对本专利技术作进一步说明。具体实施方式噬菌体展示技术是1985年由美国Missouri大学的G.P.Smith等创立的一项能够特异性筛选多肽或蛋白的技术。该技术将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，被展示的多肽或蛋白能够保持相对独立的空间结构和生物活性。目前，噬菌体展示技术已经被广泛应用于肿瘤标志物的筛选、肿瘤药物的靶向运输和多肽药物开发等方面的研究。本专利技术就是利用上述肽库以改良的肽库消减筛选法筛选可以特异敏感的结合于人乳腺癌细胞的一条本文档来自技高网...

【技术保护点】
人乳腺癌细胞特异性结合的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为：HPLGPTWRIPDT。

【技术特征摘要】
1.人乳腺癌细胞特异性结合的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列
为：HPLGPTWRIPDT。
2....

【专利技术属性】
技术研发人员：侯颖春，肖丽，高晓杰，何慧敏，薛琴琴，韩娟娟，达苗苗，马乐乐，马妮，程思楠，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61