一种检测HDR盐单胞菌的特异性引物对及其检测方法技术

本发明专利技术的涉及微生物菌检测技术领域，特别涉及一种检测HDR盐单胞菌的特异性引物对及其检测方法。其中，一种检测HDR盐单胞菌的特异性引物对，包括如下正向引物和反向引物：HaloF: ACGGCATCCGGAACTGTCA；HaloR: TCCGATCCGGACTGAGACC。本发明专利技术中的HDR盐单胞菌浓度的检测方法采用该特异性引物对对待测样品中的DNA进行荧光定量PCR扩增并读取其CT值，再根据标准菌液定量扩增后的CT值与菌液浓度N的lg N值按拟合的标准曲线以精确检测待测样品中HDR盐单胞菌浓度，具有检测快速、特异性强、操作便捷、检测准确的优点，克服了传统HDR检测技术的精度低，低浓度检测时易出现漏检的问题，对现场油井微生物防蜡技术的推广应用更具有指导意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及微生物菌检测
，特别设及一种检测皿R盐单胞菌的特异性引 物对及其检测方法。
技术介绍
油井在生产过程中，随着温度、压力的降低和气体的析出，达到一定条件时，原油 中溶解的蜡就会结晶、析出。随着温度、压力的进一步降低，石蜡将不断地析出，其结晶体便 聚集和沉淀在油管、套管、抽油杆、抽油累等管材和设备上，该种现象称为结蜡。油井结蜡会 严重影响油田的正常生产，油管壁结蜡会增加对地层的回压，降低油井产量，严重甚至将井 筒通道堵死，造成油井停产；油管和抽油杆间的结蜡会增大抽油机载荷，甚至造成抽油累蜡 卡；地层射孔炮眼累入口处结蜡，会增大油流阻力，降低累效；油层内部结蜡会大幅度降低 其液相渗透率，使油井大幅度减产甚至不出油。 近年来微生物防蜡技术克服了传统防蜡技术的缺点，不会造成地层伤害，不会产 生油井怠产，不会污染环境，可广泛应用于各种含蜡油井，是一种新型、经济、环保的油井防 蜡技术，因此越来越受到石油工业的重视。该技术针对原油含蜡的特点W及结蜡机理，筛选 合适的细菌组合注入井筒，利用微生物及其代谢产物的作用，阻止石蜡结晶，防止或缓解井 筒结蜡，达到代替或逐渐替代传统防蜡措施的目的。 在江汉油田、克拉玛依油田、江苏油田近年来油井微生物防蜡技术进行了大规模 的推广应用，取得了较好的效果。该技术应用最主要的菌种为盐单胞菌（盛皿W35)，简称 皿R，是微生物防蜡的重要菌种，目前对于该一重要功能菌的检测存在一定的难度。在定量 分析方面，目前只能根据不同微生物克隆数通过分子生物学方法确定石油姪降解菌在样品 中的相对含量，并结合样品总菌浓巧日生物显微镜计数等）进行计算获得，由于油井产出液 等环境的待测样品一般包含种类繁多、组成复杂的微生物，而且不同微生物的丰度相差巨 大。在采用传统方法分析时，一方面，生物显微镜计数误差较大，且不能做低浓度检测；另一 方面，对于丰度低的微生物，在DNA提取分析过程中可能会出现漏检；对于不同生理特性的 微生物，往往因为培养条件不适也会造成漏检，同时，传统方法存在着耗时长、过程繁杂等 一系列缺陷。
技术实现思路
本专利技术的针对现有技术中检测盐单胞菌方法存在的问题，提供一种检测皿R盐单 胞菌的特异性引物对，W便于精确检测油田产出液中皿R盐单胞菌的浓度。 本专利技术的目的该样实现的，一种检测皿R盐单胞菌的特异性引物对，其特征在 于，包括如下正向引物和反向引物： HaloF:ACGGCATCCGGAACTGTCA化loR:TCCGATCCGGACTGAGACC。 本专利技术还提供一种采用上述特异性引物对检测皿R盐单胞菌浓度的检测方法，包 括如下步骤： (1) 提取待测样品中微生物的DM; (2) 采用上述检测皿R盐单胞菌的特异性引物对，对步骤（1)获得的样品DM进行巧光 定量PCR扩增，读取巧光定量PCR扩增反应的Ct值； (3) 根据公式；CT= -3.4301gN+ 48.28 求得步骤l)中待测样品中的石油姪降解菌 浓度N。 进一步的，上述巧光定量PCR扩增的反应体系包括如下组分：9.5UL无菌水、 12.5uL化iversalSYBRGreenMasterMix、12.5uM的正向和反向引物各 0.5uL、2 yL待测样品DM。 进一步的，所述巧光定量PCR扩增的程序为；a)95。C保温5min;b)94。C保 温30s;c)64。C保温30s;d)72。C保温45S;e)重复执行b)~d)50次；f)从65 。C开始每5S增加0. 5°C至达到95。C为止。 为准确检测皿R盐单胞菌浓度，所述步骤3)中的公式Ct=-3. 4301gN+48. 28 通过如下方法拟合： A)取浓度为3. 23X109cells/血的石油姪降解菌液lOOmL，提取菌液中的DNA，溶于 无菌水中制得100yL的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀释，分别得到浓度为3. 23X109、 3. 23X108、3. 23X107、3. 23X106、3. 23X105、3. 23X104、3. 23X1〇3的标准DNA溶液样品； B) 将上步所得的各浓度的DM溶液分别采用化loF/化loR特异性引物对进行巧光定 量PCR扩增，并读取巧光定量PCR扩增反应的Ct值，再根据IgN和CT值，拟合标准DNA溶 液样品对应的菌浓与Ct值的标准曲线为： Ct= -3. 4301gN+ 48. 28,式中N为1yLDM标准样品对应的细胞数。 本专利技术中，设计了特异性引物对，再采用该特异性引物对对待测样品中的DNA进 行巧光定量PCR扩增并读取其CT值，再根据标准菌液定量扩增后的CT值与菌液浓度N的 IgN值按拟合的标准曲线W精确检测待测样品中皿R盐单胞菌浓度，具有检测快速、特异 性强、操作便捷、检测准确的优点，克服了传统皿R检测技术的精度低，低浓度检测时易出 现漏检的问题，对现场油井微生物防蜡技术的推广应用更具有指导意义。【附图说明】[001引图1为专利技术的皿R的标准DNA溶液的浓度与CT值的拟合曲线。【具体实施方式】[001引实施例1 皿R的标准DNA溶液的浓度与Ct值的曲线的拟合。A)取浓度为3. 23X109cells/mL的石油姪降解菌液100血，采用A巧gen?细菌基 因组DNA提取试剂盒（Axygen生物科技有限公司，美国）提取菌液中的DNA，溶于无菌水中 制得100化的DNA溶液，然后做10倍梯度的稀释，分别得到浓度为3. 23EX10\3. 23X108、 3. 23X107、3. 23Xl〇e、3. 23Xl〇s、3. 23X1〇\3. 23X103的标准DNA溶液样品； B)将上步所得的各浓度的DNA溶液分别采用化loF/化loR特异性引物对进行巧光定量PCR扩增，其中巧光定量PCR扩增反应体系的组分为；9. 5uL无菌水、12. 5uL化iversal SYBRGreenMasterMix、12.5uM的正向和反向引物各0.5uL、2uL样品DM。巧光定 量PCR扩增的反应程序；a)95。C保温5min;b)94。C保温30s;一64。C保温30s; d)72。C保温45s;e)重复执行b)~d)50次；f)从65。C开始每5S增加0. 5。C 至达到95 °C为止；g)读取巧光定量PCR扩增反应的Ct值。记录各标准菌液的浓度N与 Ct值关系如表1。表中N示1 y LDNA样品对应的细胞数。由于检测时，该DNA溶液来源于100血样品 的菌液提取的DNA溶于适量无菌水中制备得到的100 y LDNA溶液，经RT-PCR巧光定量扩 增得到表1及标准曲线Ct=-3.430IgN+ 48. 28,标准曲线的拟合度R2=0.9952如图 1所示。那么，样品中的菌液浓度为：N(Cll/yL) X 100 yl/100血=N(Cell/mL) 因此，N即代表样品菌浓，按照本标准曲线可W检测lO4~1〇9Cell/mL菌液浓度的现场样品， 另外，如果菌浓较低可W进行离屯、浓缩测定。[001引 实施例2 比较例 针对某微生物防蜡措施的油井采出液，使用现有技术中的一种皿R的选择性培养基 逐级稀释平板培养测定和本方法同时测定采出液水体中皿R纯菌浓度，采用本专利技术的特 异性引物对检测皿R盐单胞菌浓度的检测方法下简称本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测HDR盐单胞菌的特异性引物对， 其特征在于，包括如下正向引物和反向引物：HaloF: ACGGCATCCGGAACTGTCAHaloR: TCCGATCCGGACTGAGACC。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚峰，王彪，时维才，林晶晶，郑海男，雷世华，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司江苏油田分公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32