一种高致病性嗜水气单胞菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高致病性嗜水气单胞菌及应用，所述的高致病性嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）ZYAH72，保藏编号：CCTCC NO: M2015797。将该嗜水气单胞菌制备成灭活疫苗，得到的疫苗安全无毒害，通过浸泡和注射两种方式均能获得较好的免疫效果，广谱性好。疫苗制作方式快速简便，易于大量制备，本发明专利技术为水产类细菌性败血症的防治提供了切实可行的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物疫苗
，特别涉及一种高致病性嗜水气单胞菌及应用。
技术介绍
嗜水气单胞菌是一种革兰氏阴性菌，系气单胞菌科气单胞菌属，普遍存在于淡水，污水，淤泥，土壤和人畜粪便中，在自然界中广泛分布。该菌可感染鱼类、两栖动物、软体动物，甚至鸟类、爬行类以及哺乳类等多种动物，由其引发的感染或细菌性败血症可导致动物大量死亡。嗜水气单胞菌是我国鱼类养殖史中危害鱼种类最多、鱼龄范围最大、分布区域最广、流行季节最长的一种重要急性传染病。同时，该病原引发的感染广泛分布于世界范围内，给水产养殖大国带了经济损失。研究发现鱼类一旦感染嗜水气单胞菌发病速度极快，发病鱼通常表现为眼球突出，腹下出血，严重时腹部水肿膨胀。该菌的致病机理尚不十分清楚，目前已知的在导致鱼类感染过程中发挥重要作用的致病因子包括核酸酶、气溶素、胞外蛋白酶、肠毒素、溶血素等。由该菌引起的疾病主要以抗生素和化学药物控制为主，但是抗生素和化学试剂过量使用可导致细菌耐药性增强，并引起环境污染，甚至导致抗生素或化学试剂残留引发食品安全问题。因此，接种疫苗成为预防鱼类病害的最重要手段。目前若干嗜水气单胞菌灭活疫苗已经制备并被证实对特定菌株具有部分免疫保护效果，但由于嗜水气单胞菌菌株有致病性和非致病性菌株之分，所携带毒力因子具有多种组合，因此普遍认为只有筛选带有多种毒力因子的强毒力菌株用于制备灭火疫苗才能更好保护水生生物抵抗不同嗜水气单胞菌致病菌株的感染。因此，筛选一株含有多种毒力因子的强毒力菌株，将其制备灭活疫苗显得尤为重要。CN105031636A通过PCR方法筛选不同来源的菌株，将其中含有气溶素(aerA)、肠毒素(alt)、丝氨酸蛋白酶(ahp)以及溶血素(β-hly)四个毒力因子的一株菌株灭活，制备成口服疫苗，获得良好效果，能为银鲫提供相对保护率46.7％。申请人通过筛选，获得了一株至少具备5个毒力因子的高致病性嗜水气单胞菌，经验证，该菌可作为商业疫苗进行生产，具备广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种高致病性嗜水气单胞菌，该菌株已于2015年12月29日送往中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)ZYAH72，保藏编号：CCTCCNO:M2015797，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供一种高致病性嗜水气单胞菌在制备嗜水气单胞菌感染疫苗中的应用，利用本专利技术提供的疫苗，可克服以往灭活疫苗保护效果不高和难以抵抗不同致病菌株感染的弊端，该疫苗特别适用于水产动物的由水气单胞菌引起的嗜水气单胞菌性败血症。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种高致病性嗜水气单胞菌的获得：申请人自发病或濒死的鱼中，从患病部位划线至TSB固体培养基上，进行致病菌的筛选，通过革兰氏染色镜检、16SrDNA测序、溶血实验、PCR扩增嗜水气单胞菌相关毒力基因、斑马鱼半数致死量实验、小鼠半数致死实验，最终获得了一株高致病性嗜水气单胞菌，该细菌已于该菌株已于2015年12月29日送往中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)ZYAH72，保藏编号：CCTCCNO:M2015797，地址：中国武汉武汉大学。该菌株在血琼脂平板上具有较强的溶血活性，含有气溶素(aerA)，丝氨酸蛋白酶(ahp)，溶血素(hly)，肠毒素(alt)，金属蛋白酶(ast)等五个毒力因子，在生化实验中呈氧化酶、阿拉伯糖、七叶苷、精氨酸双水解酶、葡萄糖产气、水杨素为阳性反应，6％NaCl胨水为阴性反应。在普通TSB固体培养基或液体培养基中生长良好，生长所需适宜温度为28-30℃。一种高致病性嗜水气单胞菌在制备嗜水气单胞菌感染疫苗中的应用，包括利用现有方法将该菌制备为由水气单胞菌引起的水产动物的细菌性败血症疫苗，或其为有效成分之一与其他疫苗制备为多联疫苗。所述的水产动物包括但不限于：草鱼、鲫、鳙、鲢、鳜、鲤、青鱼、罗非鱼、鳗鲡、白鲫、银鲫、鲟、黄尾鲴、鳊、斑点叉尾鮰、金鱼、黄鳝、牙鲆等鱼类；还包括蛙、大鲵、虾、蟹、鳖、龟等水生动物。本专利技术所述的嗜水气单胞菌还可用于制备哺乳动物的嗜水气单胞菌感染疫苗，特别是小鼠的嗜水气单胞菌感染疫苗。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1、与通过抗生素和化学药物防控该病原相比，疫苗具有成本低，特异性高，环境友好型的特点。2、含有较多的毒力因子，可提供更多的有效免疫原。3、该菌株在活体中的致病性强于致病标准株，并且高于本实验室分离的其他菌株。4、本疫苗不需要佐剂就能获得较好的免疫效果，并能有效抵抗嗜水气单胞菌的感染。5、能够为帮助鱼类抵抗不同来源的嗜水气单胞菌致病菌株的感染。6、疫苗的效果在鱼类和哺乳动物中均得到验证。7、使用本专利技术的疫苗，可以有效的预防由嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症，减少鱼类患病率和死亡率，从而减少淡水鱼养殖业的经济损失。8、使用本专利技术提供的疫苗，可显著增强水产动物的免疫力，提高抗病表型。附图说明图1为嗜水气单胞菌ZYAH72溶血活性检测示意图。图2为嗜水气单胞菌ZYAH72的毒力因子PCR扩增示意图。其中M：DNAMarker2k，泳道1-5依次为aer、alt、ahp、ast、hly基因。图3为嗜水气单胞菌ZYAH72和致病标准株的毒力比较示意图。图4为嗜水气单胞菌ZYAH72生长曲线示意图。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。所述试剂或材料，如未特别说明，均来自于商业渠道。实施例1：一种高致病性嗜水气单胞菌的获得：(1)筛选具有多种毒力因子的强致病性嗜水气单胞菌A.在超净台中解剖发病或濒死的鱼中，从患病部位划线至TSB固体培养基上，28℃培养18h-24h，挑取平板上单菌落转接至新鲜培养基上纯培养；在TSB固体培养基上典型菌落为圆形，浅黄色，半透明，表面光滑，湿润，边缘整齐的菌落。B.取上述平板上纯培养的单菌落，用法国梅里埃公司的API细菌鉴定试剂条进行生化鉴定(见表1)，并进行革兰氏染色观察菌落形态。表1：分离株部分生理生化鉴定结果C.扩增候选菌株的16SrDNA并测序，在与数据库中已有的嗜水气单胞菌数据进行同源性比对，结果显示其同源性为99％。D.根据生理生化检测，革兰氏染色镜检菌落形态及16SrDNA测序结果确定分离的菌株为嗜水气单胞菌；E.筛选能够表达溶血素并具有溶血活性的菌株，本专利技术最终获得的Z本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高致病性嗜水气单胞菌，其特征在于：嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）ZYAH72，保藏编号：CCTCC NO: M2015797。

【技术特征摘要】
1.一种高致病性嗜水气单胞菌，其特征在于：嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）ZYAH72，保藏编号：CCTCCNO:M2015797。
2.权利要求1所述的嗜水气单胞菌在制备嗜水气单胞菌感染的疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周洋，李锦铨，林蠡，赵丽娟，王小红，李智，喻蔚，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42