本发明专利技术公开了铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因ＰＡ０１７１。属于微生物生物技术领域。本发明专利技术与铜绿假单胞菌致病性的研究息息相关，此基因大小为５４３ｂｐ，国际上对该基因的功能没有报道。实验发现该基因的缺失能够使Ⅳ型菌毛介导的蹭动能力丧失。蹭动能力在铜绿假单胞菌生物被膜形成的早期起着必不可少的作用。生物被膜的形成提高了铜绿假单胞菌的耐药性，常在临床上引起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问题。用铜绿假单胞菌生物被膜形成相关基因ＰＡ０１７１为新药靶点研制抗菌药物，为临床治疗和耐药防治服务。
【技术实现步骤摘要】
第l/9页铜绿假单胞菌蹭ffit动相关基因賴W7/鹏用fe^领域本专利技术属于微生物生t/^术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌蹭fi^动相关基因， 即IV型菌秘动相关基因層77。背景^铜绿假单胞菌(/^"ab^朋s朋r收//70^)属假单胞菌属，革兰氏阴性菌，它是一种分布广泛的剝4 菌，在临床上它能引起菌血病、耳、眼、^!^:软组织、骨及关节、心内 膜和呼吸系统等的感染,是人类的三大致病菌之一'是引越市炎的首要致病菌。由于其具有形成生 物鹏等多重耐药机制，耐药率高,常在临床上引起顽固性、难治性感染,成为临床治疗的棘手问 题。细菌生物MJ1或称为菌膜，是细菌为适应不利的自然环境、维持自身生命而发生的,学变 化，形成一种有利于生存的棘的生命5嫁。当生物体内的细菌处于生长发育不利的环境时，菌 体周边会分泌多糖复合物，使细菌相互粘连，附着于隋性物体如生物医^t才料^f占膜表面并将其 自身包绕在其中而形成的J^t物，使细菌可以停留在一^S宜的微环境中而不会被冲散。生物被 膜的这种特殊结构可以作为一种屏障保护细菌抵御抗菌药物的杀伤和^m宿主免疫系统的清除， 而成为潜在的感染源，导致难治性临床生物M的相关感染。IV型菌毛介导的蹭动(twitching motility)参与了生tfW的早期形成。对生物 形^^几制的研究，国内尚未见相关报道。由于生物MJ1有非常錢的临床意义， 就几年，已弓胞国夕卜些科学家的重视，使他们涉;Sitb领鹏行研究。但其形淑几制仍有许多 未知领域樂娥索。目前已知，生辦鹏的形成^t分为三步个体细胞的吸附；微M:的形成； 及成BW的发育。劍门对铜绿假单胞菌生#1 形細关基因尸^/77的研究可以i辩卜国内这一领域的空白，并完善铜绿假单胞菌生tfMW成的禾腿。
技术实现思路
l本专利技术目的是鹏铜绿假单胞菌生物净鹏形淑目关基因、即IV型菌秘动相缝 因并用该基因为新药耙点研伟 糊绿假单胞菌的新型药物。本专利技术鄉的铜绿假单胞菌IV型菌秘动相关基因層7人具有如序列親示核苷,列，其基因长度为543bp。上述的铜^fg单胞菌IV型菌秘动相关基因賴W7/可以用于以该基因为新药耙点设计并制 Mt菌药物；以及在食品卫生和耐药防^方面的自。本专利技术基因的获得方法^f顿A!Mu转座技术(一种基于噬菌体Mu转座子的转座技术)， 誠铜绿假单胞菌基因突变，M:突变子文库。筛遨曾动能力丧失的突变子，〗顿5^HI酶切基 因组DN入酶切片段与pUC18载体连接，fflil电转化将连接，导入^^杆菌DH5ct，用卡那霉素 和氨节青霉素双抗LB平板筛选阳性转化子，测定转化子中插入片段的核苷,列，发现Mu插入 的基因，确定此基因与铜绿假单胞菌IV型菌^S动有相关性。本专利技术的有^^:实验发现本专利技术基因的缺失倉辦使IV型菌毛介导的蹭动能力丧失。Mu插入失活基因使细菌蹭辦g力丧失，说明此基因与铜绿假单胞菌IV型菌毛的运动有关，这 对IV型菌^M动相关新基因的发现以及揭示新基因的功能都有指导意义。fflil^专利技术，可以针对尸，"7基因设计药物，限伟唭正常鋭，使得细菌无^ii^斷 M动 形成生物鹏，斷碟耐药性，超鹏疗铜绿假单胞菌弓胞的感染的目的。附图说明1图1鹏动能力丧失的阳性转化子的蹭动运动检测图1 、野生型PA68作为阳性对照 2、賴0/7/::Mu PA68突变株 图2是Mu克隆，切产物电泳图1、 DL15000 2、质粒3、质粒酶切 图3是Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)1、 DL20002、 Mu克隆子PCR产物。 用Mul和Mu2作为引物，克隆子质粒DNA为丰嫩，可以扩增出700bp的特异性片段，说明所 检测的克隆子质粒中携,插入了 Mu转座子的基因片段。具^6^式鄉例l:顿MU转座技术进行突变子文库的建立(1) 将临床分离株铜绿假单胞菌PA68接种于50mlL-broth培养基(10g/L胰蛋白胨，5g^酵 母粉，5g^LNaCl)中，37°C， 200 rpm振荡培养过夜。(2) 次日按l: 100接种至200mlL—broth培养基中，200rpm， 37"培养至00540^0.5，终止培养。(3) 于2。C 7000 g离心10 min，收集菌体。(4) 依次用200ml、 100 ml 、 40 ml在冰浴中预冷的300 mM蔗糖溶Mf^浮、洗涤菌体，2 。C誦g离心10min，倒净鰣。(5) 根据菌体的多少用不同《斜只的300mM蔗糖溶液混匀，并fflii^ffl胞计数伟恪成浓度约为1011 个cells/ml的感受态细胞。(6) 将感受态细胞條成100 yl滑，1分直接用于电转化，1分在液氮中冷冻后，放—80 。CftKf昏中保存。另1分直接放一8(TC》條昏保^&用。(7) 取感受态细胞100 li 1、质粒pSMC28和Mu转座复合物约50ng，加入到在冰浴中预冷的0.2 cm 电转化杯中(阴'断照只加感受态细 加质粒)，在BioRad电穿孑L处设置电容25uF,电阻 200 S^P口誠的电压誠电击。(8) 电击后将转化体系转入予跣37。C温浴的900ulL"broth培养基中。37°C， 225ipm， i歸lh 。(9) 取100 y L菌液涂布于50 u g/ml Km抗性平肚，温箱37°C过夜培养，24小时后即可观察结 果。(10) ^il夜培养的筛选平fei:挑取数个M^，分别接种到1 ml的L—broth中，37°C， 200 rpm 振荡培养16—18 h。(11) 取2iil菌液t^嫩，以AXMu转座子上的特异序列Mul (5， -GCMCTGTCCATACTCTGA-3，) 和Mu2 (5， - CGCTGGGTTTATCGTCGA-3，)做引物，用PCR方feT增Mu转座子片段。同时分别以 铜绿假单胞難株^M粒pHTH2做阴'极阳',照。扩增^j牛为，先在94。C1^性15min，然后， 94。C^fil min， 55。C退火l min， 72。C延伸1 min，共30个循环，雜72。C延伸10 min。(12) PCR产tT&0.鄉琼月識,中电泳检测，EB染色后紫外灯下观察结果并留照片，具有700bp 卡那霉素抗性基因的转化子即为Mu转座复合,化子。鄉例2:突变子蹭动能力的检测(D在无菌塑料:t歸皿内铺上一层蹭动能力检测培养基[10g/L胰蛋白胨，5g/L酵娜，5g/LNaCl，1% (W/V)颗粒状琼月謝]。(2)从Mu转座子突^t库中活化突变菌株。5(3) 用灭菌的牙翻陬菌落，矛逾曾动培养基，将细菌接种到線基下面的塑料平皿上37'C培养 24小时。(4) 细菌就会依赖IV型菌毛的收縮和伸展在培养基下面的塑料表面以接种点为圆心，向周围蔓延生 长，产生圆形的菌晕。(5) 将培养皿轻揭去，用考马司^染色液(10%乙酸，0.06烤马司亮兰)染色塑料平皿20分 沐倒掉染液，用自来水冲群皿lmin，观察细菌因蹭动而产生的环，筛淑曾动能力丧失或織g 的突变子(图1)。^BI例3:铜绿假单胞菌蹭动能力相关基因的克隆 1 Mu转座复合tl^化子基因组DNA的提取(1) 将铜绿假单胞菌Mu转座复合物转化子針5mL LB液体培养基中，3CTC 200rpm过夜培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种铜绿假单胞菌蹭行运动相关基因ＰＡ０１７１，其核苷酸序列如序列表所示，其基因长度为５４３ｂｐ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔明强，姚宏明，单志英，徐海津，白艳玲，张秀明，靳永新，刘力伟，牟锐，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。