本发明专利技术涉及一种对亲水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)O抗原特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸包括1）SEQ ID NO:1-8所示的核苷酸中的至少一种；2）与SEQ ID NO:1-8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测亲水气单胞菌用PCR试剂盒和基因芯片。本发明专利技术的对亲水气单胞菌O抗原特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片的实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及对亲水气单胞菌044, 024, 025和028血清型特异的核巧酸，尤其设及 对亲水气单胞菌044,024,025和028血清型0抗原基因簇中单个基因特异的核巧酸及其应 用。
技术介绍
亲水气单胞菌（Aeromonashy化ophila)属于弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短 杆菌，没有芽抱和芙膜，又名嗜水气单抱菌。亲水气单胞菌广泛存在于自然界众多水体中， 是多种水生动物的原发性致病菌。为条件性致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。它 通过肠道进入机体，可W产生毒性很强的外毒素，引起暴发性出血病。一般情况下，菌体对 肠道组织的粘附力越强，其产生的外毒素的毒性就越强。亲水气单胞菌的血清型很多，症状 也各异，由亲水气单胞菌感染的疾病一般病情严重，多位恶性传播，死亡率较高。 细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法W及分子鉴定方法。然 而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型运 种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和 储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的0抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。 亲水气单胞菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为亲水气单胞菌菌种与株型 鉴定的重要依据，不少新菌也因此产生。对弧菌而言，生化反应主要是各种酶谱的表现，属 于外部形态的内容，核酸的相似性才是弧菌种的界定最根本、最直接的特征。因此，亲水气 单胞菌的分型与鉴定最有效、最直接的方式应该从核酸的研究触发，通过比较核酸(包括基 因组与核酸片段）的相似性确定亲水气单胞菌的归属。 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区ατ巧序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFL巧分析等。分子生物学方法不仅可用于亲水气单胞菌的快速血清分型筛查， 稳定的鉴定结果可W弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，运些基于多聚 酶链式反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快 速、灵敏、特异性强等优点。 聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离屯、及裂解制备 细菌DNA模板，就可W在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中 是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。运对检验检疫部 口和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。 不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为亲水气单胞菌的 防控提供有效技术支持是十分重要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种对亲水气单胞菌0抗原特异的核巧酸，其特征在于 所述的核巧酸具有： 1)沈Q ID NO: 1-8所示的核巧酸中的至少一种； 2)与SEQ ID NO: 1-8所示的核巧酸互补的核巧酸中的至少一种；所述的SEQ ID NO: 1-8 如下：本专利技术还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DM聚合酶，所述PCR引物为如SEQ ID N0:l-8所示的核巧酸中的至少一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 ml dNTP 30 μ 1 ; 10 X酶特异性反应缓冲液50 μ 1 ;5U/ μ 1耐热DNA聚合酶5 μ 1;引物混合 物10 μ 1;阳性对照品10 μ 1;阴性对照品10 μ 1 ;d地2〇5ml。 其中所述的PCR引物优选为所述如SEQ ID NO: 1-8所示的核巧酸中的至少一种。 本专利技术进一步公开了一种对亲水气单胞菌0抗原特异的SEQ ID NO: 1-8核巧酸在 制备用于检测亲水气单胞菌0抗原PCR试剂盒、基因忍片或微阵列方面的应用。 本专利技术所述亲水气单胞可W取样于自来水、污水、海水的培养物的粗提液、瓜果蔬 菜中、病体标本或是亲水气单胞菌的纯培养物的粗提液。 收集亲水气单胞菌提取基因组是采用常规方法制备获得。 针对亲水气单胞菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳检 测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后 的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。 本专利技术还提供一种基因忍片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核巧酸探 针，其中所述寡核巧酸探针包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸优选为如SEQ ID NO: 1-8所 示的核巧酸。 本专利技术还提供一种微列阵，其包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸优选为如SEQ IDNO: 1-8所示的核巧酸。检测亲水气单胞的基因忍片方面、检亲水气单胞微阵列方面的应 用。所述亲水气单胞菌是检测由于污染水源和未煮熟、未清洗的食物引起的急性胃肠炎、外 伤感染、肠道传染病、医院内感染等多种混合型感染的细菌。 本专利技术公开的一种对亲水气单胞菌0抗原特异的核巧酸与现有技术相比，本专利技术 具有如下优点： (1)实用性强：本专利技术建立的一种PCR反应体系，可检测亲水气单胞菌，提供血清分型 检测所用到的特异引物，利用该PCR方法可W对临床标本进行检测。 (2)准确性高：本专利技术通过对亲水气单胞菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每 个样品得到一条目的条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可W得到亲水气单胞菌 所属的血清型。 (3)检测成本相对较低：可W推广应用于食品卫生监督、环境监测、尚品监测检验 检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。W上所述，仅是本专利技术的操作和实施方法而已，并非对本专利技术作任何形式上的限 审IJ，凡是依据本专利技术的技术实质对W上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍 属于本专利技术技术方案的范围内。【附图说明】： 图1表示本专利技术044血清型特异引物检测亲水气单胞菌其他血清型标准菌株电泳结果 图，WZX基因P1和P2引物的筛选，目的条带为15化P，其余的血清型没有任何条带具体菌株 信息见表2; 图2表示本专利技术044血清型特异引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了 6株弧 菌W及1株沙口菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图3表示本专利技术024血清型WZZ基因P3和P4引物检测亲水气单胞菌其他血清型标准 菌株电泳结果图，WZZ基因P3和P4引物的筛选，目的条带为194bp，其余的血清型没有任何 条带。具体菌株信息见表2; 图4表示本专利技术024血清型WZZ基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中 检测了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大肠杆菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2 ; 图5表示本专利技术025血清型r巧基因P5和P6引物检测亲水气单胞菌其他血清型标准 菌株电泳结果图，r巧基因P5和P6引物的筛选，目的条带为18化P，其余的血清型没有任何 条带，具体菌株信息见表2; 图6表示本专利技术025血清型wzy基因P5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对亲水气单胞菌O抗原特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有：1）SEQ ID NO:1‑8所示的核苷酸中的至少一种；2）与SEQ ID NO:1‑8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，许广楠，王敏，许玲玲，张新杰，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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