肝癌细胞表面特异性结合的多肽制造技术

本发明专利技术公开了一种肝癌细胞表面特异性结合的多肽，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到一条多肽片段，其氨基酸序列为：LWDMSTPHRPLT。本发明专利技术利用噬菌体多肽展示技术筛选肝癌细胞结合的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体克隆与肝癌细胞的亲和力，获得8个噬菌体克隆，测序获得4条多肽序列，其共有氨基酸序列为L(H)***S(T)*P(H)H(S)*P(L)LT(L)，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合肝癌细胞，筛选获得的肝癌细胞特异性多肽为肝癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供实验依据。

【技术实现步骤摘要】
肝癌细胞表面特异性结合的多肽
本专利技术涉及生物
，涉及筛选肿瘤组织特异性结合肽，特别是一种肝癌细胞表面特异性结合的多肽(序列)。
技术介绍
肝癌(Hepatocarcinoma)是消化道常见恶性肿瘤之一。在中国，肝癌是发病率高、死亡率高、治疗费用高的疾病。我国是世界上肝癌高发区之一，其肝癌发病率约为欧美地区的10倍。就死亡率而言，肝癌在我国恶性肿瘤死亡率位居第二，仅次于肺癌，每年约50万人死于肝癌，而且发病率和死亡率一直处于上升趋势。因为肝癌在早中期可能不会有症状，所以多数癌症病人就诊时已是晚期，错过了肝癌治疗的最佳时间。晚期肝癌的有效治疗方案很少，病人多数前景不好。所以，要提高肝癌术后生存率和降低死亡率的关键就在于早期发现、早期诊断和早期治疗。但是，目前对肝癌由于仍然缺乏特异的、廉价的、方便的早期诊断方法，所以对肝癌的早期检出率仍很低，病人死亡率仍很高。噬菌体展示技术(PhageDisplayTechnology)是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(如抗体、酶和细胞表面受体等)的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药物靶向运输等方面的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种由噬菌体展示十二肽库筛选得到的、对肝癌细胞表面特异性结合的多肽序列，并提供鉴定该多肽与肝癌细胞的亲和力和特异性的实验结果，证明该多肽在肝癌的早期分子影像学诊断、靶向化疗、与其它材料偶联而进行的肝癌靶向治疗等方面具有的巨大应用价值。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：肝癌细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示十二肽库筛选得到一条多肽片段，其氨基酸序列为：LWDMSTPHRPLT。该多肽片段能够特异性结合肝癌细胞，而不识别人胚肾细胞(即正常细胞)，并对其他消化道肿瘤细胞表现出极低亲和力或者无亲和力。上述肝癌细胞表面特异性结合的多肽的筛选方法，利用噬菌体随机十二肽库，以体外培养的肝癌细胞HepG2系为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞系为吸附细胞，进行4轮全细胞消减筛选，随机挑取30个噬菌体克隆扩增并滴定，利用酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆，比较阳性克隆与HepG2细胞的亲和力，提取阳性噬菌体克隆单链DNA测序，将测序结果比对后获得拥有“共有序列”的阳性克隆组4个，对这4条公有序列组以细胞免疫荧光法鉴定它们的特异性和敏感性，最后，获得了本专利技术所提供的肽序为最佳肽序。以该肽序列为模板合成荧光标记的肝癌特异性多肽探针(命名为FITC-Hepa探针)，进一步以肝癌细胞和消化道其他癌细胞、肝癌临床组织标本芯片来鉴定该多肽对肝癌细胞和组织的特异性和敏感性。各种噬菌体水平和合成肽(FITC-Hepa探针)水平的免疫荧光实验结果进一步提示该多肽能够特异性结合人肝癌细胞和组织，这为肝癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向纳米药物的研发提供了实验依据。附图说明图1是噬菌体克隆位点序列特征；图2是精简遗传密码子表；图3是10个阳性噬菌体克隆与HepG2细胞亲和力的ELISA鉴定；图4是阳性克隆靶向HepG2细胞的免疫荧光检测结果，其中：A：肝癌细胞HepG2；B：肝癌细胞SMMC7721；C：HEK293细胞；D：结直肠癌细胞；E：胃癌细胞；F：食道癌细胞；G：对照多肽与HepG2细胞；H：PBS对照；图5是HCC1靶向肝癌细胞部位的激光共聚焦显微镜检测结果。其中：A：肝癌HepG2细胞；B：肝癌SMMC7721细胞；C：HEK293细胞。以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。具体实施方式本专利技术是在以往曾经筛选的基础上，利用同样筛选方法和材料再次筛选获得的一种对人肝癌细胞具有很好的结合特异性和敏感性的12肽序列。肽库筛选实验结果即何种肽序的获取完全具有不确定性，对于本领域技术人员来讲具有不可预料性。一、技术路线本专利技术采用噬菌体多肽展示技术，以人肝癌HepG2细胞系为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞进行4轮消减筛选，从噬菌体12肽库中筛选能特异性结合肝癌HepG2细胞的多肽基序，检索其可能识别的细胞表面受体，为肝癌早期诊断和靶向治疗的进一步研究提供良好的实验依据，具体技术路线如图1所示。二、材料与方法2.1主要实验材料2.1.1细胞、噬菌体肽库、宿主菌(1)细胞株：人肝癌细胞株HepG2，人胚肾细胞株HEK293，购于美国ATCC(Rockville，美国)。(2)噬菌体肽库：随机十二肽噬菌体展示文库(Ph.D.-12TMPhageDisplayPeptideLibraryKit)购自NewEnglandBiolabs，USA。(3)宿主菌：大肠杆菌E.coliER2738：购自NewEnglandBiolabs，USA。(4)细胞培养基：RPMI1640完全培养基，购自美国Invitrogen公司。2.2实验方法2.2.1细胞培养用RPMI1640完全培养基、37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱。2.2.2宿主菌E.coliER2738的培养E.coliER2738是NEB公司的Ph.D系列噬菌体肽库的专用菌株。用LB-Tet培养基、37℃恒温摇床、300rpm振荡过夜。2.2.3噬菌体展示十二肽库的消减筛选以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞，肝癌HepG2细胞为靶细胞，参照随机十二肽噬菌体展示文库(Ph.D.-12TMPhageDisplayPeptideLibraryKit)使用说明书，优化改良筛选方法，进行4轮消减筛选，保持每一轮筛选投入噬菌体量不少于1.5×1010PFU。第一轮筛选程序如下：(1)细胞准备：将生长状态良好的人肝癌细胞HepG2和人胚肾HEK293细胞，分别传代，接种于10cm2细胞培养瓶，置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱培养24h后换液，培养至细胞贴壁，生长状态良好，待融合度为90％以上,汇合成单层细胞时进行筛选。(2)细菌活化：将过夜振荡培养的ER2738以1:100稀释于20mlLB-Tet液体培养基中，37℃，225rpm，缓慢振摇2～3h至对数前期，于紫外分光光度计上测OD600～0.5。(3)封闭：取融合度为90％以上的HEK293细胞，吸弃培养基，用PBS轻轻洗涤两次，加无血清培养基，37℃、5％CO2培养1h，吸去培养液，加入Blockingbuffer(3％BSA+PBS)，37℃封闭2h；重复同样操作，封闭肝癌细胞HepG2细胞。(4)洗涤：吸弃封闭液，用0.1％TBST轻柔地洗涤6次，操作要避免细胞脱落。(5)阴性细胞吸附：将10μl噬菌体库(第2轮至第4轮筛选取扩增库1.5×1010PFU)与1mlTBS混合，与HEK293细胞孵育，37℃，孵育1h，孵育期间每隔15min放脱色摇床上微摇。(6)取上清：用吸管缓慢吸取上清，转移至2ml灭菌离心管，1000rpm，离心5min，转移上清至新离心管，再离心一次以去除上清中可能含有的细胞。(7)结合：迅速将上清与本文档来自技高网...

【技术保护点】
肝癌细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：LWDMSTPHRPLT。

【技术特征摘要】
1.肝癌细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯颖春，郭永娥，高晓杰，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61