用于增殖毛囊干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种高产地增殖毛囊干细胞的方法，更具体地，涉及一种通过使用包含特定浓度的Rho相关激酶(ROCK)抑制物的特定培养基来培养细胞的大量地增殖毛囊干细胞的方法，以及涉及在所述方法中使用的培养基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种高产地增殖毛囊干细胞的方法，更具体地，本专利技术涉及通过使用含有特定浓度的Rho相关激酶(ROCK)抑制物的特定培养基来培养细胞的大量增殖毛囊干细胞的方法，以及涉及在所述方法中使用的培养基。
技术介绍
近来，随着对美容的兴趣越来越浓，对于治疗秃头症的关注也有所增长。秃头症是指在通常长有毛发的皮肤区域上的毛发脱落。尽管毛发不具有直接涉及生命的重要的生理功能，但就美观和阻挡UV光线并保护头部的功能而言，毛发起到非常重要的作用。严重的毛发脱落不仅对社交生活而且对心理都会具有负面的影响，因此就生活质量而言，毛发很重要。脱发可以分为两类皮肤有瘢痕的瘢痕性毛发脱落(scarring hair loss);以及仅毛发脱落的非瘢痕性毛发脱落。在瘢痕性毛发脱落的情况下，毛囊被破坏，因而毛发永远不会再生。毛发在毛囊中生长，并且每个毛囊都经历生长和休止的重复循环。毛发循环的间隔根据身体的部位而变化。头部的毛发经历大约2-6年的生长期(生长期)、大约2-4星期的衰退期(退行期)、以及大约3-4个月的休止期(静止期)。在人的一生中，每个毛囊经历10-20个毛囊生长循环。 已提出多种治疗毛发脱落的方法，但是近些年，采用基因治疗毛发脱落的方法受到了关注。例如，已经开发了使用基因结构将理想的DNA密码直接递送到毛囊中的治疗方法或者抑制基因表达的治疗方法。然而，还没有完全确定这种治疗方法的功效、费用及安全性以及这种方法对后代的影响。因此，即使找到参与毛发脱落的基因，在采用所述基因治疗毛发脱落的方法被安全使用之前仍需要大量的时间。同时，报道了一种毛发再生方法，所述方法包括在生长期采取处于毛球与毛发附接状态的毛发，培养毛囊细胞，并且将经培养的细胞移植到曾被采取毛发的位点。然而，此方法并不很有效。同时，提出了使用干细胞治疗毛发脱落的方法。这种方法包括鉴定毛囊干细胞并且分析所述细胞的基因并且这些基因是期望被用于治疗毛发脱落或诸如烧伤的其他皮肤疾病的。表皮干细胞的概念自30年前起已经被讨论。毛发生长是一种独特的循环再生现象，并且毛囊干细胞的位置和功能对于理解毛发生长的生物学和病理学是至关重要的议题(Oshima H. et al.，Cell, 104 :233_245，2001)。发现干细胞的一个特征，标记保留细胞，存在于毛囊的永久上部，所谓的隆突区(参见Cotsarelis G. et al. , Cell,61 :1329-1337,1990)。然而，尚未清楚地建立培养这种毛囊干细胞的方法。尽管已知毛囊干细胞存在于一些毛囊中，然而需要大量的干细胞用于人类秃头的临床治疗，而增殖经分离的干细胞使所述干细胞多到能够被临床应用的技术仍不令人满意。此外，尚未明确地鉴定用于干细胞的标记蛋白，因此使用干细胞来治疗毛发脱落的方法仍不令人满意。因此，本专利技术人做了大量的努力来生产大量的毛囊干细胞，并且结果发现了在含有特定浓度的Rho相关激酶(ROCK)抑制物的各种培养基中，特定种类的培养基能够增殖并且保持较大量的毛囊干细胞，因此完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种生产大量的毛囊干细胞的培养基。本专利技术的另一目的在于提供一种使用所述培养基以使所述毛囊干细胞能够被临床应用这样大的量增殖毛囊干细胞的方法。本专利技术的又另一目的在于提供一种治疗毛发脱落的组合物，所述组合物含有通过所述方法获得的作为活性成分的大量的毛囊干细胞。为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于增殖并保持毛囊干细胞的培养基，所述培养基在基础培养基中含有5-50 μ M的Rho相关激酶(ROCK)抑制物。此处，所述基础培 养基可以是选自由M199/F12 (混合物)培养基、MEM- α培养基、含低浓度葡萄糖的DMEM培养基、MCDB 131培养基以及IMEM培养基构成的组中的一种。此处，所述含低浓度葡萄糖的DMEM培养基含有大约1000mg/L浓度的葡萄糖。在上述培养基中，尤其优选M199/F12 (混合物)培养基或MEM-α培养基。所述基础培养基优选地含有ITS+(胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸)预混合物、EGF、bFGF以及抗生素，例如，抗生素/抗真菌的混合物。特别地，所述ROCK抑制物的浓度优选的是5-20 μ Μ，并且更优选的是大约10 μ M0本专利技术还提供了一种增殖并保持毛囊干细胞的方法，所述方法包括将经分离的毛囊干细胞在培养基中传代培养，所述培养基包括补充了 5-50μΜ的Rho相关激酶(ROCK)抑制物的基础培养基。此处，优选地将所述经分离的毛囊干细胞作2-6轮传代培养，并且在细胞培养期间以每2天的间隔更换培养基。本专利技术还提供了一种治疗秃头症或毛发缺乏的细胞治疗组合物，所述组合物含有通过所述方法获得的作为活性成分的大量的毛囊干细胞。此处，所述组合物可进一步包括相对容易分离的脂肪干细胞。附图说明图I至5是示出在9种培养基中培养的毛囊干细胞的照片。图6和7示出在各种浓度的ROCK抑制物之间，毛囊干细胞的增殖能力的比较。图8是在市售M199/F12培养基组中与在M199/F12培养基中含有ITS+预混合物、EGF, bFGF以及抗生素/抗真菌的混合物的组合物之间，毛囊干细胞的增殖能力的比较。图9是示出通过用二氢睾酮诱导小鼠的毛发脱落，分别给予盐水、3%米诺地尔(minoxidil)、毛囊干细胞、脂肪干细胞以及毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合，并且在0-14周每周测量小鼠的毛发脱落的情况而获得的结果的一系列图表。图10是示出通过用二氢睾酮诱导小鼠的毛发脱落，分别给予盐水、3%米诺地尔、毛囊干细胞、脂肪干细胞以及毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合，并且在6-14周每周拍照小鼠的毛发脱落情况而获得的结果的一系列照片。图11是示出通过用睾酮诱导小鼠的毛发脱落，分别给予盐水、3%米诺地尔、毛囊干细胞、脂肪干细胞以及毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合，并且在0-16周每周测量小鼠的毛发脱落情况而获得的结果的一系列图表。图12是示出通过用睾酮诱导小鼠的毛发脱落，分别给予盐水、3%米诺地尔、毛囊干细胞、脂肪干细胞以及毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合，并且在6-16周每周测量小鼠的毛发脱落情况而获得的结果的一系列图表。图13是示出通过给予毛囊干细胞和脂肪干细胞的组合并且在0-6周(O周给药的时间点)每周拍照小鼠的毛发脱落情况而获得的结果的一系列照片。用于实施本专利技术的最佳实施方式以下将详细描述本专利技术。干细胞指不仅具有自我复制的能力而且还具有分化为至少两类细胞的能力的细胞。成体干细胞是出现在发育过程后形成胚胎的各器官的时期或出现在成年期的干细胞。已知成体干细胞是多能的并且能够分化成组织特异性细胞以及器官特异性细胞。这种多能干细胞，即能够分化成对含有这些细胞的组织和器官特异的细胞的干细胞不仅参与胎儿、新生儿以及成年时期的各种组织和器官的生长和发育，还参与成年组织的内稳态的维持以及在组织损坏时诱导再生的功能。本专利技术涉及成体干细胞的有效培养，特别地，涉及源自上皮组织的毛囊干细胞的有效培养。毛囊干细胞包括大约10%的位于上皮的基底层(也称为毛囊间上皮)的干细胞，以及出现在毛囊中的干细胞。特别地，已知作为未分化细胞的毛囊干细胞在上皮再生中起到重要的作用。 用于本专利技术的毛囊干细胞可从包括人类的所有哺乳类的上皮组织(例如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.06 KR 10-2009-01071841.一种用于增殖并保持毛囊干细胞的培养基，所述培养基在基础培养基中含有5-50 ii M的Rho相关激酶(ROCK)抑制物。2.如权利要求I所述的培养基，其中所述基础培养基进一步含有ITS+预混合物(胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸预混合物)、EGF、bFGF或抗生素。3.如权利要求I所述的培养基，其中以5-20u M的浓度含有所述Rho相关激酶(ROCK)抑制物。4.如权利要求I所述的培养基，其中以10ii M的浓度含有所述Rho相关激酶(ROCK)抑制物。5.如权利要求I所述的培养基，其中所述基础培养基是选自由M199/F12(混合物)培养基、MEM- a培养基、含低浓度葡萄糖的DMEM培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗廷灿，姜成根，禹相奎，金美爱，尹恩智，
申请(专利权)人：RNL生物技术株式会社，
类型：发明
国别省市：