本发明专利技术涉及一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法，其具体步骤为：将准备拔取毛发的部位贴根部剪去至仅留0.2-0.3cm左右毛发根，75％酒精消毒10min；漂洗；将单根毛发种入培养皿中，采用毛囊干细胞培养基培养；1周后每3-4天换液一次；E、逆转录病毒包装；诱导毛囊干细胞重编程为iPS细胞；毛囊干细胞来源的iPS细胞维持培养及鉴定。本发明专利技术过程简单；无需蛋白酶消化成单细胞；扩增的毛囊干细胞中β-整合素和角蛋白-19阳性率达90％以上；为皮肤缺损的快速修复、毛囊干细胞的生长与发生的分子机理研究、表观遗传学研究和重编程为诱导多能干细胞提供充足的种子细胞来源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞领域，特别涉及。
技术介绍
根据细胞发育进程可将干细胞分为成体干细胞(adult stem cells)和胚胎干细胞(embryonic stem cells),根据干细胞的分化潜能等特点,可将干细胞可分为全能干细胞(totipotent stem cells)、多倉泛干细胞(pluripotent/multipotent stem cells)、专倉泛干细胞(unipotent stem cells)和终末分化细胞。全能干细胞可以分化形成人体所具有的全部细胞、或发育形成新的个体，是指在早期胚胎发育过程中的受精卵及受精卵进一步分裂形成2个、4个或8个卵裂球时期的细胞。多能干细胞(英文表述为pluripotent stem cells)可以分化形成人体所具有的全部细胞、但不能发育形成新的个体，主要存在于胚胎之中。在早期胚胎发育过程中，受精卵进一步分裂形成的桑椹胚，桑椹胚再进一步分化形成胚泡；胚泡的成胚体细胞，及在此阶段以前的细胞，只要提取一个细胞，都可以可以分化形成人体所具有的全部细胞。另一概念上的多能干细胞(英文表述为multipotent stem cells)已经是上述细胞的发育更晚时期了，如各胚层的细胞、及造血干细胞。这些细胞可以分化成很多种细胞，如造血干细胞可以分化成各种白细胞、红细胞、血小板等。单能干细胞或专能干细胞，只能分化成一种细胞，或者是分化成关系比较密切的两种细胞(在特殊条件下也可以发生横向分化)。 单能干细胞存在非常广泛，在大部分组织器官都有存在。胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)是一种来源于早期胚胎、能在体外长期传代培养、维持正常核型、具有自我更新和分化发育为3个胚层组织细胞潜能的多能性细胞。1981年英国Evans等人建立起第一个小鼠的用生化胚胎干细胞株。此后，科学家又相继建立了猪、牛、绵羊、山羊、兔、水貂、仓鼠、恒河猴、狨等ES细胞系。为研究细胞分化、动物发育、建立相关研究模型、阐明基因功能等开辟了广阔的研究空间。1998年，美国威斯康星大学Thomson教授，在征得胚胎所有者同意后，从做试管婴儿剩余的胚胎中分离出胚胎干细胞，并在体外培养成功。同年，美国约翰-霍普金斯大学的Gearhart教授等人从早期(约6周)流产胚胎的卵巢和睾丸组织中分离出原始生殖干细胞，并建立了胚胎生殖干细胞系。随着同源重组技术在小鼠等哺乳动物遗传修饰动物模型中的广泛应用、哺乳动物体细胞核移植技术的建立和日益完善、ES细胞在体外定向分化手段的日益多样化和成熟，使得ES细胞在多个领域，如细胞治疗、组织工程等方面展示了巨大潜力，被认为是细胞移植替代治疗的未来的希望。2006年，Yamanaka等系统研究小鼠和人ESCs多潜能性相关因子时发现4个转录因子0ct4, Sox2, Klf4, c-Myc,将这四个因子导入鼠成纤维细胞后,成纤维细胞重编程形成ESCs类似的多能干细胞,被称为诱导多能干细胞(mouse induced Pluripotent Stem cells, miPSCs)。2007 年 Yamanaka 和 Yu 等分别独立建立了人 iPS 细胞系(human iPSCs,hiPSCs)。这一研究成果被誉为生命科学新的里程碑，它不仅为研究多能性的调控机制带来了观念上的创新和提供了新的研究模型，更为解决目前干细胞移植治疗中最大难点之-移植后的免疫排异问题-开辟了新的途径。iPSCs细胞在形态、多能性维持和分化潜能上与ESCs —致，且克服了 ESCs不可避免的伦理学争议和异体细胞移植排斥等问题。因此， hiPSCs已逐渐代替hESCs成为未来临床转化医学重要的细胞来源。近几年来，研究者们陆续从多种细胞类型中重编程获得hiPSCs细，如皮肤成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、肝脏细胞和胃上皮细胞、神经前体细胞、胰岛细胞、人皮肤和毛囊角质形成细胞、脂肪干细胞、羊水来源细胞、血液前体细胞、神经干细胞、脐带血干细胞、脐带华通胶和羊膜来源细胞、外周血T淋巴细胞等。这种通过活检或其他借助外科手段获取种子细胞制备患者特异性的iPS有望克服胚胎干细胞治疗中所带来的免疫排斥和深层的伦理学问题。上述不同的体细胞在hiPSCs重编程过程中有着不同的特点，并且上述方法在获取所需要的种子细胞过程当中，因为要借助于活检或抽血等手段，将会对患者造成一定程度上的损伤，所以需要一种新的微创或无创的方法获取种子细胞，并且这种种子细胞能高效率地被再程序化为iPS细胞。
技术实现思路
针对
技术介绍
中的问题，本专利技术提供以下技术方案—种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法，其具体步骤为A、将准备拔取毛发的部位贴根部剪去至仅留O. 2-0. 3cm左右毛发根，75%酒精消毒 IOmin ；B、用清洁眉镊快速将发根拔出，并快速置入无菌的PBS中漂洗；C、将单根毛发种入培养皿中，采用毛囊干细胞培养基培养；D、每天观察毛发的生长情况，I周后每3-4天换液一次； E、逆转录病毒包装采用试剂Fugene6和PLAT A细胞进行逆转录病毒的包装，分别利用pMX-h0ct4、pMX-hSox2、pMX_hKlf4和pMX-hc_Myc包装出四种逆转录病毒；F、通过逆转录病毒感染毛囊干细胞，促使其表达外源的人类0ct4、Sox2、Klf4和 c-Myc基因，诱导毛囊干细胞重编程为iPS细胞；G、毛囊干细胞来源的iPS细胞维持培养及鉴定。作为本专利技术的优选技术方案，，所述步骤A中小剪刀、镊子及棉球临用前灭菌， 最好准备一间无菌间，或经紫外灭菌的房间，或病人家中(临时用70%的乙醇喷洒整个房间)；如采集头发者，剪去耳后2cmX2cm大小面积的长发，仅留2-3毫米长的毛发，用70%的乙醇棉球擦除被剪毛发部分及周边部分IOXlOcm大小面积，五min后再用70%的乙醇棉球擦一次。作为本专利技术的优选技术方案，，培养所述步骤C中的毛囊干细胞培养基为含1% B27、10ng/mL bFGF 和 50ng/mL EGF 的 DMEM/F12。作为本专利技术的优选技术方案，，所述步骤E中转染前2天，准备4个IOOmm培养皿，各接种2 X 106个PLAT A细胞；转染当天，4个IOOmm培养皿的PLAT-A细胞汇合度达到 70%，符合转染所需细胞数量要求；取4个EP管，每个加300ul OPT1-MEM和27ul Fugene6，轻轻弹匀，室温孵育 5min ;pMX_h0ct4、pMX_hSox2、pMX_hKlf4 和 pMX-hc-Myc 各 9 μ g 分别加至上述4个EP管内，充分混匀后，室温孵育15min ;将上述4个EP管内混合液分别加至4 个IOOmm培养皿，轻轻摇匀培养皿后，放置在37°C，5% C02的温箱进行培养；转染24h后，4 个培养皿进行换液，各加IOmL不含双抗的PLATA基本培养基；转染48h后，收集4个含转录因子病毒上清至一个50mL离心管，混匀，约36mL ;收集上述病毒后用于感染毛囊干细胞。作为本专利技术的优选技术方案，，所述步骤F中用1:1 :1 :1的上述四种混合逆转录病毒感染提前24h准备的细胞总数为O. 5-1x105的成纤维细胞，并选用10ng/mL Polyb本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培养扩增人类毛囊干细胞及重编程为诱导多能干细胞的方法，其特征在于，其具体步骤为：A、将准备拔取毛发的部位贴根部剪去至仅留0.2?0.3cm左右毛发根，75％酒精消毒10min；B、用清洁眉镊快速将发根拔出，并快速置入无菌的PBS中漂洗；C、将单根毛发种入培养皿中，采用毛囊干细胞培养基培养；D、每天观察毛发的生长情况，1周后每3?4天换液一次；E、逆转录病毒包装：采用试剂Fugene6和PLAT?A细胞进行逆转录病毒的包装，分别利用pMX?hOct4、pMX?hSox2、pMX?hKlf4和pMX?hc?Myc包装出四种逆转录病毒；F、通过逆转录病毒感染毛囊干细胞，促使其表达外源的人类Oct4、Sox2、Klf4和c?Myc基因，诱导毛囊干细胞重编程为iPS细胞；
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谌兵来，高擎，曾桥，
申请(专利权)人：谌兵来，高擎，曾桥，
类型：发明
国别省市：
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