大鼠毛囊干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及大鼠毛囊干细胞的分离培养方法，该方法包括以下步骤：1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；2）培养条件为37℃、5%CO2培养箱中，每2-3d换液一次；3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLETMExpress(1X)，no Phenol Red，37℃消化8-10min；4)毛囊干细胞的纯化。本发明专利技术由于采用了上述的技术方案，得到了理想的毛囊干细胞。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，该方法包括以下步骤：1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；2）培养条件为37℃、5%CO2培养箱中，每2-3d换液一次；3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLETMExpress(1X)，no?Phenol?Red，37℃消化8-10min；4)毛囊干细胞的纯化。本专利技术由于采用了上述的技术方案，得到了理想的毛囊干细胞。【专利说明】
本专利技术涉及干细胞、皮肤组织工程学领域，尤其涉及一种大鼠毛囊干细胞的分离、培养、纯化、鉴定方法。
皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。随着社会经济的发展，特别是作为“世界工厂”的我国制造业和手工业的繁荣发展，各种涉及皮肤缺损的外伤特别是烧伤、压轧伤、切割伤等也越来越多。其中，外伤导致的皮肤大面积缺损常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤,极大增加了患者痛苦,而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。正因如此，科学家们一直试图寻找一种外源性的皮肤替代物。早在公元前1500年，异种皮肤移植就被用于临时覆盖皮肤缺损创面。而随着组织工程学的创立和发展，皮肤组织工程学迅速兴起，并成为近十年来研究的热点。组织工程学是应用工程学及生命科学的原理与方法，研究生物替代物，以用于重建、保持或提高组织功能的一门学科。目前，国外应用皮肤组织 工程学构建人工皮肤的研究已取得了实质性进展，Apligraf, OrCel,Suprathel> Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等产品已先后被美国药品与食品管理局(FDA)批准上市并已应用于临床皮肤缺损的治疗中。然而，虽然目前已有以上数种人工皮肤产品可供临床选择，也确实促进了对大面积皮肤缺损患者的临床治疗。但是，根据我们多年临床应用过程中遇到的问题，结合文献报道，我们认为目前人工皮肤移植还存在着许多问题，其中甚至包括可能导致治疗最终失败的“硬伤”:①由于以上人工皮肤产品都没有血管生成能力，导致移植的人工皮肤没有血管系统供给营养，从而使人工皮肤容易发生坏死，使移植失败。②人工皮肤产品中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，严重的甚至出现全身免疫反应等严重并发症，并且有可能传播疾病。③目前所有的人工皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，而无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，例如:血管、毛发、汗腺等。毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出了高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从患者自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对患者完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。Taylor等(Taylor G，Lehrer MS, Jensen PJ，et al.1nvolvement of follicular stem cells informing not only the follicle but also the epidermis.Cell, 2000, 102(4):451-461.)研究发现毛囊干细胞不仅能够分化形成毛囊，而且还参与了表皮组织的形成过程。Stelios等发表的最新研究结果证明，头发毛囊中含有大量的干细胞，是最容易获得的干细胞来源之一，并已成功将毛囊干细胞分化发育生成新的脉管系统。血管内皮细胞生长因子165 (VEGF165)是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是VEGF体内发挥作用的主要亚型。近年来围绕VEGF165为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。为此 申请人:申请了一种VEGF165基因修饰毛囊干细胞的方法，该方法以毛囊干细胞为种子细胞，具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应；同时利用VEGF165基因转染修饰毛囊干细胞，能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管系统，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。
技术实现思路
为了解决目前毛囊干细胞的来源问题，本专利技术的目的是提供。本专利技术的毛囊干细胞具有体外培养时能快速大量扩增，来源非常丰富，减小免疫排斥反应的特点，能够很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案:I)选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37°C消化2h ;用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，I周后毛囊隆突部 有细胞爬出，形成克隆；所述的DMEM/F12补充培养基成分为:44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500 μ I青链霉素混合液、500 μ I L-谷氨酰胺、500 μ I非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50 μ I羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；2)培养条件为37°C、5%C02培养箱中，每2_3d换液一次；3)毛囊干细胞的传代消化条件为:TrypLE?Express (IX), no Phenol Red,37°C消化8-10min ；4)毛囊干细胞的纯化:将100 μ g/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置Ih ;将IOOmm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。本专利技术由于采用了上述的技术方案，得到了理想的毛囊干细胞，可以对该毛囊干细胞进行基因修饰，然后以此为种子细胞，种植于三维明胶海绵组织支架，构成成具有新的血管系统的新型复合人工皮肤模型。该模型具有以下独特的优点:①作为干细胞，毛囊干细胞具有体外培养时能快速大量扩增，长期体外传代培养，细胞功能旺盛等特点，并且具有很高的再生和分化能力，这将极大缩短体外培养扩增时间，提闻临床治疗效率；②由于能够形成具有扩张和收缩功能的新的工程血管系统，将很好的解决移植人工皮肤容易坏死，成活率低的问题；③本研究中所用的种子细胞一毛囊干细胞取自自体毛发，来源非常丰富，也非本文档来自技高网...

【技术保护点】
大鼠毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤，置入0.25%Dispase酶37℃消化2h；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；所述的DMEM/F12补充培养基成分为：44mlDMEM/F12培养液、5mlKSR血清替代物、500μl青链霉素混合液、500μl L‑谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重组人表皮细胞生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、50μl羟基乙醇、10ng/ml氢化可的松；2）培养条件为37℃、5%CO2培养箱中，每2‑3d换液一次；3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLETMExpress(1X)，no Phenol Red，37℃消化8‑10min；4)毛囊干细胞的纯化：将100μg/ml的IV型胶原按照3ml/100mm dish的量包被在培养皿中，室温静置1h；将100mm培养皿的原代细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞后，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，20min后，将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出；贴壁的细胞用完全培养基培养，每3天换液；P2代再纯化一次。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：全仁夫，黄忠名，郑宣，许世超，
申请(专利权)人：杭州市萧山区中医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33