【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于组织工程皮肤，具体涉及一种预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤及其制备方法。
技术介绍
1、我国作为制造业和手工业大国，出现各种涉及皮肤缺损的外伤，特别是烧伤、压轧伤、切割伤，而大面积皮肤缺损的有效治疗是临床上至今未能解决的难题之一。当前的主要解决方案包括异体移植、干细胞治疗和组织工程等，其中组织工程皮肤不造成二次伤害、可大批量生产、无免疫排斥，是一个重要的发展方向。
2、组织工程皮肤是采用工程化手段制备可降解支架，而后在该可降解支架上负载细胞和因子等获得的，当将该组织工程皮肤移植至生物体上时，支架在细胞生长分化、组织形成的过程中会逐渐降解消失，形成自体皮肤。它为构建皮肤替代物提供了新的方法，具有良好的发展前景，也对创面愈合困难者产生较理想的治疗效果，有着十分重要的临床意义。
3、如公开号为cn109045360a的中国专利技术专利申请公开了一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法，该制备方法包括：1)将胶原蛋白与丝素蛋白分别溶于蒸馏水中，配成3.0～4.0％的胶原蛋白水溶液以及1.0～2.0％的丝素蛋白水溶液中；2)将胶原蛋白水溶液与丝素蛋白水溶液按照溶质蛋白质量比1:1～5:1混合，在将制备好的黄芪多糖/壳聚糖微球加入到混合液中，充分搅拌混匀；3)将上述含有微球的混合溶液加至事先做好的模具容器内，-30～-20℃预冻成型，然后-65～-55℃真空干燥48h～72h，获得的工程皮肤三维支架。
4、该工程皮肤三维支架的不足之处在于：
5、又如公告号为cn109321513b的中国专利技术专利公开了一种具有生理功能的组织工程皮肤构建方法，该构建方法包括：1)将牛i型胶原蛋白溶液、dmem培养基和毛囊真皮成纤维细胞混合均匀，制成细胞凝胶，滴加在人羊膜支架上；2)细胞凝胶凝固后，在条件培养液中培养，然后在细胞凝胶表面接种毛囊干细胞，体外培养，直至生成具有生理功能的组织工程皮肤。
6、上述组织工程皮肤具有如下不足：(1)需要获取人胎盘和毛囊干细胞，其中人胎盘较难获取，来源有限，而获得足够多而纯的毛囊干细胞用于构建组织工程皮肤也是一个挑战；(2)步骤1)制备的真皮等同物中还含有毛囊真皮成纤维细胞，而毛囊真皮成纤维细胞的存在会使得皮肤创伤位置真皮层较厚，甚至可能形成疤痕性皮肤；(3)皮肤创面早期血管化程度较低，创面恢复周期长。
技术实现思路
1、本专利技术的专利技术目的是提供一种预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤及其制备方法，该组织工程皮肤的原料来源广泛且易于获取，将该组织工程皮肤用于全层皮肤缺损修复时，不仅能够加速创面胶原和血管新生，加快重塑损伤皮肤营养内环境，还能够直接参与形成具有隆突的新生毛囊，最终实现较为完整的结构性和功能性新生皮肤重建。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案为：
3、一种预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤，包括支架、形成于支架上的胶原层和接种于胶原层上的vegf165基因修饰的ips-hfscs。
4、本专利技术首次研究发现，ips-hfscs(即由多能干细胞诱导分化而来的毛囊干细胞)不仅表现出与人毛囊干细胞相同的促进宿主新生皮肤的毛囊重建的功能，还直接参与形成具有隆突的新生毛囊，从而促进创面愈合。
5、基于此发现，本专利技术构建了上述组织工程皮肤，该组织工程皮肤以ips-hfscs作为种子细胞，支架上的胶原层不仅能够作为ips-hfscs的粘附基础，还能够促进ips-hfscs增殖，从而使得组织工程皮肤能够更多地参与形成新生毛囊，进一步提高创面愈合速度。
6、同时，本专利技术采用的ips-hfscs是从ips细胞定向诱导获得的，而ips细胞又是由从创伤组织中提取到的成纤维细胞重编程获得的，而创伤组织易于获取，来源广泛，可以获得大量的ips-hfscs；并且，ips-hfscs具有vegf165基因修饰，这就使得ips-hfscs在皮肤愈合过程中还能够加速宿主源性的创面胶原和血管新生，促使创面早期血管化，为创面修复提供良好了的微血循环内环境，一举两得，最终实现较为完整的结构性和功能性新生皮肤重建。
7、作为优选，在上述的预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤中，所述的胶原层中含有黄芪多糖，且黄芪多糖的浓度为100-400μg/ml；更优选地，所述的胶原层中黄芪多糖的浓度为200μg/ml。
8、研究发现，黄芪多糖与胶原配合能够进一步促进ips-hfscs增殖，且当黄芪多糖的浓度设置在100-400μg/ml之间时，ips-hfscs的增殖效率较优，在200μg/ml黄芪多糖下，ips-hfscs的增殖效率达到最高。
9、在上述的预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤中，所述的支架为海藻酸钠-丝素蛋白3d打印可降解支架；
10、所述的支架由至少一层片状基材叠置组成(层高0.1mm的情况下，优选3-5层)，每层基材上均形成有若干直径为0.75-0.8mm的孔隙。
11、本专利技术中的支架以海藻酸钠和丝素蛋白作为支架材料，采用3d打印工艺制成。海藻酸钠不仅具有良好的亲水性、组织相容性和生物降解性，而且成本低廉，利用海藻酸钠代替部分丝素蛋白制成的支架不仅成本降低，而且同样有利于细胞的粘附生长、创面的渗出吸收，具有无细胞毒性和免疫原性、调节炎症反应、加快创面愈合的优势。同时，由于本专利技术设置的支架具有多孔结构，在3d打印完成时材料仍呈凝胶状，需要立即固化才能保持其多孔结构，而海藻酸钠的加入有利于实施该固化操作。
12、本专利技术采用3d打印技术制作支架，3d打印技术不仅速度快、效率高，而且能够根据预定的尺寸和孔隙率设计出符合皮肤细胞生长的三维结构，更具有灵活性及可重复性。
13、本专利技术的海藻酸钠-丝素蛋白3d打印可降解支架上的孔隙直径在0.75-0.8mm之间(孔隙率在40-60％之间为宜)，该多孔结构有利于创口处细胞的增殖迁移、物质交换和新生组织的生长；呈片状的支架不仅便于移植，而且可有效覆盖创面，从而起到减少创面出血、体液渗出，降低感染机率等作用。
14、本专利技术还提供了上述的预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
15、(1)制备海藻酸钠-丝素蛋白3d打印可降解支架；
16、(2)在所述的海藻酸钠-丝素蛋白3d打印可降解支架滴加含黄芪多糖的胶原蛋白溶液，待胶原转为凝胶后固化，获得黄芪多糖-胶原-海藻酸钠-丝素蛋白3d打印可降解支架；
17、(3)在该黄芪多糖-胶原-海藻酸钠-丝素蛋白3d打印可降解支架上接种vegf165基因修饰的ips-hfscs，经共培养后获得所述的组织工程皮肤。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤，其特征在于，包括支架、形成于支架上的胶原层和接种于胶原层上的VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs。
2.如权利要求1所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤，其特征在于，所述的胶原层中含有黄芪多糖，且黄芪多糖的浓度为100-400μg/ml。
3.如权利要求2所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤，其特征在于，所述的胶原层中黄芪多糖的浓度为200μg/ml。
4.如权利要求1所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤，其特征在于，所述的支架为海藻酸钠-丝素蛋白3D打印可降解支架；
5.如权利要求1-4中任意一项所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的海藻酸钠-丝素蛋白3
7.如权利要求6所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，步骤(1.2)中，所述的打印参数包括：
8.如权利要求5所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，按体积百分数计，所述的胶原蛋白溶液中含0.1-0.3％的I型胶原；
9.如权利要求5所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的制备方法为：
10.如权利要求9所述的预载有VEGF165基因修饰的iPS-HFSCs的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，所述的定向诱导操作的实施过程为：
...【技术特征摘要】
1.一种预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤，其特征在于，包括支架、形成于支架上的胶原层和接种于胶原层上的vegf165基因修饰的ips-hfscs。
2.如权利要求1所述的预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤，其特征在于，所述的胶原层中含有黄芪多糖，且黄芪多糖的浓度为100-400μg/ml。
3.如权利要求2所述的预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤，其特征在于，所述的胶原层中黄芪多糖的浓度为200μg/ml。
4.如权利要求1所述的预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤，其特征在于，所述的支架为海藻酸钠-丝素蛋白3d打印可降解支架；
5.如权利要求1-4中任意一项所述的预载有vegf165基因修饰的ips-hfscs的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的预...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜伟斌，胡华辉，全仁夫，
申请(专利权)人：杭州市萧山区中医院，
类型：发明
国别省市：
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