一种用于处理生物样本的组合物制造技术

本发明专利技术涉及一种用于处理生物样本的组合物。该用于处理生物样本的组合物由药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂、pH值调节剂组成，其质量比为2.0-12.0：2.5-12.0：0-0.4：0-0.5。本发明专利技术提供的组合物在用于富集生物样本中的单个核细胞等时，在部分参数上超越了目前可商购获得的国内外同类产品，具有更高的安全性和有效性，为此类产品的临床转化创造了可能。

【技术实现步骤摘要】
—种用于处理生物样本的组合物
本专利技术涉及一种用于处理生物样本的组合物及液体介质，属于生物材料
。
技术介绍
利用离心法富集生物样本中的生物颗粒是生物学研究中应用最为广泛的一项技术。许多生物颗粒均可以通过离心法这一技术实现富集，例如，动物或植物的细胞、亚细胞结构、细菌、病毒或生物大分子等。这些在悬液中的生物样本在离心作用下的表现主要取决于生物样本的大小和密度，这可以通过斯托克斯方程(Stokes equation)得到解释。斯托克斯方程(见下式)描述了球形颗粒在液体介质中受到离心作用时运动速率的变化规律: d2( P2-P1) X g- 其中:d代表球形颗粒的直径，P2代表球形颗粒的密度，P1代表液体介质的密度，η代表液体介质的粘度，g代表离心力。通过斯托克斯方程很容易得到如下结论:(1)沉降速率与颗粒大小成正比；(2)沉降速率和颗粒密度/液体介质的密度差成正比；(3)当颗粒和液体介质的密度相等时，颗粒的沉降速率为零；(4)沉降速率与液体介质的粘度成反比；(5)沉降速率与离心力成正比。根据斯托克斯方程，离心法富集颗粒需要借助一种适宜材料的液体介质得以实现，在这种液体介质中，不同的生`物颗粒由于其各自的颗粒大小、颗粒密度或其它理化及生物学特性不同而具有不同的表现，从而实现其各自的富集目的。依据生物颗粒在液体介质中的表现类型不同，可以将离心法富集生物颗粒分为差速离心和密度梯度离心，而密度梯度离心又可以进一步被分为速率-区带离心和等密度离心。等密度离心法是一种在细胞生物学中广泛用于富集特定细胞的技术方案，其原理如上述由斯托克斯方程所得到的结论(3)中所阐释的那样:由于所选择的液体介质的密度等于或略大于欲富集的目的细胞，因此目的细胞在离心作用下，无论离心时间长短，都将无法穿透液体介质的界面沉到离心容器的底部，进而在液体介质的界面处(即平衡位置)得到富集。典型的等密度离心法是利用单次密度梯度离心法纯化血液或骨髓样本中的淋巴细胞，其中所采用的液体介质通常是含有聚蔗糖-碘化物组合配方的具有生理渗透压的水溶液。可商购获得的此类产品有很多种，例如通用电气医疗集团(GE Healthcare)的产品Ficoll-Paque?PLUS、西格玛集团(Sigma)的产品Histopaquel077?等。这些常用的液体介质大多采用相同的主要原料作为配方，即聚蔗糖400 (Ficoll 400)和泛影酸钠(Diatrizoate),这是20世纪70年代由Boyum等人逐渐建立并不断优化而得到的十分成功的配方体系。选择这两种主要原料作为介质配方是有其深刻原因的，J Graham在他的著作Biological Centrifugation中详细总结了适合作为密度梯度介质的材料应具备的特性，包括(I)能够制备所需密度范围的足够的溶解度；(2)在所需密度范围内不形成高粘度的溶液；(3)当待分离的生物样本对渗透压敏感时，密度梯度介质既不高渗也不低渗；(4)可以调节PH值等参数与待分离的生物样本保持一致；(5)不影响样本的生物学活性；(6)无毒且不被细胞代谢；(7)不与离心管反应，且不影响检测过程；(8)容易从纯化的产品中去除；(9)价格低廉等。应当指出，没有一种产品可以同时满足上述全部特性，因此适用于不同生物样本的多种产品应运而生。例如，DNA的密度在1.50-1.80g/cm3之间，应选用高密度介质氯化铯或硫酸铯溶液等。聚蔗糖400和泛影酸钠的组合配方除了能提供足够的密度，又能够避免过高的粘度影响分离效率，因此成为了细胞纯化操作中构建密度梯度介质的一种良好选择。具体而言，聚蔗糖400是一种化学合成的高分子聚合物，平均分子量约为400kD，可溶于水，其最大水溶液密度可高达1.23g/mL，大于血液或骨髓样本中密度最大的红细胞，适用性较广。此外，聚蔗糖400由于其多羟基大分子的特殊结构，可与红细胞表面吸附结合，破坏红细胞表面的电荷层，从而降低红细胞之间的静电斥力，并通过“桥联”模式促使红细胞出现缉1钱状沉淀。聚鹿糖400这种促进红细胞聚集沉降的作用对于淋巴细胞的纯化是至关重要的。根据斯托克斯方程可知，红细胞发生聚集而得的聚集体由于其具有更大体积而显著加速了其沉降速度，这不仅大大提高了纯化效率，更重要的是对于数量占绝对多数的红细胞的去除而言，这种聚集沉降的作用保证了较高的淋巴细胞纯度，有效减少了红细胞的污染。然而，这种促进红细胞聚集沉降的作用也有其负面影响，盛佳等报道了高分子对于红细胞的这种聚集沉降作用随分子量变大而增强(盛佳等，红细胞聚集的生物力学基础，《力学进展》，1999年，第29卷，第I期)，可知聚蔗糖400对于红细胞的这种聚集沉降作用较强，而过快的沉降会致使淋巴细胞等目的细胞陷入红细胞聚集体而发生目的细胞群的非特异性丢失，这也是离心法进行淋巴细胞纯化操作中低收率的一个原因。综上所述，红细胞的这种聚集应受到合理控制，高分子这种促进聚集的作用应在适宜的范围内，速度应适中。泛影酸钠是临床常用的一种小分子离子型碘对比剂，其与聚蔗糖400组合可以进一步为组合体系提供适宜的粘度和渗透压以提高纯化效率。利用密度梯度介质完成淋巴细胞的富集是一项常规的实验操作，其一般步骤包括:(I)用一定比例的平衡盐溶液或生理盐水对血液或骨髓样本进行预稀释；(2)将稀释后的样本小心沿离心容器壁加入预装有密度梯度介质的离心容器中，保持样本与介质的界面清晰，不发生混合；(3)在一定温度和一定离心条件下进行离心，比如20° C时，离心力为400g的条件下离心30分钟；(4)小心从离心机中取出装有样品的离心容器，利用巴斯德吸管或移液管等装置吸取富集在样本和介质层交界面处的“白膜层” ；(5)用一定比例的平衡盐溶液、生理盐水或细胞培养基洗涤得到的细胞产品，除去血小板、细胞碎片与部分死细胞，以及残余的密度梯度介质；(6)将得到的细胞悬液用于细胞培养等后续实验，在临床应用方面，特别是在细胞移植或成分输血的情况中，得到的细胞悬液可能将被直接输注入人体。含有聚蔗糖400-泛影酸钠组合配方的在售的密度梯度介质产品已可以满足实验室生物学研究的大部分需要。然而，这种组合配方对目的细胞的生物学影响也是不可忽略的，特别是其对一些特定细胞表面抗原表达量的影响已在多篇文献中见诸报道。例如，Watson等人报道了聚鹿糖介质对嗜中性粒细胞表面抗原的影响(Watson F等人，Neutrophil function in whole blood and after purification:changes inreceptor expression, oxidase activity and responsiveness to cytokines,Biosc1.Rep.1992，12(2): 123.) ；LundahI等人报道了通过聚鹿糖-泛影酸钠组合配方分离而得的单核细胞与通过氯化铵裂解而得的单核细胞相比，⑶Ilb/⑶18比例发生了显著改变(Lundahl J 等人，Altered expression of CDllb/CD18 and CD62L on human monocytesafter cell preparation procedures, J.1mm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于处理生物样本的组合物，其由药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂、pH值调节剂组成，其质量比为2.0?12.0：2.5?12.0：0?0.4：0?0.5；优选为3.5?12.0：3.5?12.0：0?0.3：0?0.4；更优选为5.0?12.0：5.0?11.0：0?0.25：0?0.4。

【技术特征摘要】
1.一种用于处理生物样本的组合物，其由药学上可接受的羟乙基淀粉、药学上可接受的离子型碘对比剂、渗透压调节剂、PH值调节剂组成，其质量比为2.0-12.0:2.5-12.0:0-0.4:0-0.5 ;优选为 3.5-12.0:3.5-12.0:0-0.3:0-0.4 ;更优选为 5.0-12.0:5.0-11.0:O-0.25:0_0.4。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述药学上可接受的羟乙基淀粉为分子量在130kD以上的药学上可接受的羟乙基淀粉；优选地，所述药学上可接受的羟乙基淀粉为羟乙基淀粉200/0.5和/或羟乙基淀粉130/0.4。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述药学上可接受的离子型碘对比剂为醋碘苯酸钠、甲泛葡胺、泛影葡胺和泛影酸钠中的一种或几种的组合。4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中，所述渗透压调节剂为无毒的药学上可接受的酸加成盐。5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其中，所述pH值调节剂为无毒的药学上可接受的酸、多元酸的酸式盐和缓冲对中的一种或几种的组合。6.一种用于处理生物样本的液体介质，以重量百分比计，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉2.0-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂2.5-12.0wt%、渗透压调节剂0-0.4wt%、pH值调节剂0-0.5wt%和余量水组成；优选地，以重量百分比计，该液体介质由药学上可接受的羟乙基淀粉3.5-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂3.5-12.0wt%、渗透压调节剂0-0.3wt%> pH值调节剂0-0.4wt%和余量水组成；更优选地，该液体介质由药学上可接受的轻乙基淀粉5.0-12.0wt%、药学上可接受的离子型碘对比剂5.0-11.0wt%、渗透压调节剂0-0.25wt%、pH值调节剂0-0.4wt%和余量水组成。7.根据权利要求6所述的液体介质，其中，该液体介质的pH值为5.0-7.5，优选为6.1-7.5。8.根据权利要求6或7所述的液体介质，其中，该液体介质的渗透压为270-335m0sm/kg ;优选地，该液体介质的渗透压为280-320m0sm/kg。9.根据权利要求6或7所述的液体介质，其中，该液体介质的密度为1.070-1.085g/mL ;优选地，该液体介质的密度为1.077-1.083g/mL。10.根据权利要求6-9任一项所述的液体介质，其中，该液体介质为无菌的，并且，内毒素含量< 0.5EU/mL。11.根据权利要求6-10任一项所述的液体介质，其中，所述药学上可接受的羟乙基淀粉为分子量在130kD以上的药学上可接受的羟乙基淀粉；优选地，所述药学上可接受的羟乙基淀粉为羟乙基淀粉200/0.5和/或羟乙基淀粉130/0.4。12.根据权利要求6-11任一项所述的液体介质，其中，所述药学上可接受的离子型碘对比剂包括醋碘苯酸钠、甲泛葡胺、泛影葡胺和泛影酸钠中的一种或几种的组合。13.根据权利要求6-12任一项所述的液体介质，其中，所述渗透压调节剂为无毒的药学上可接受的酸加成盐；优选地，所述无毒的药学上可接受的酸加成盐包括无机酸盐和/或有机酸盐，其中，所述无机酸盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和磷酸氢盐中的一种或几种的组合，所述有机酸盐包括乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、D-乳酸盐、L-乳酸盐、D-酒石酸盐、L-酒石酸盐、丙二酸盐、烟酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、葡糖酸盐、琥珀酸盐和苯甲酸盐中的一种或几种的组合；更优选地，所述渗透压调节剂包括盐酸盐、磷酸氢盐、乙二胺四乙酸盐和碳酸盐中一种或几种的组合；更优选地，所述渗透压调节剂包括氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的一种或几种的组合。14.根据权利要求6-13任一项所述的液体介质，其中，所述pH值调节剂为无毒的药学上可接受的酸、多元酸的酸式盐和缓冲对中的一种或几种的组合；优选地，所述无毒的药学上可接受的酸包括无机酸和/或有机酸，所述无机酸包括盐酸、硫酸、硝酸和磷酸中的一种或几种的组合，所述有机酸包括甲酸、乙酸、富马酸、马来酸、苯磺酸、D-乳酸、L-乳酸、D-酒石酸、L-酒石酸、丙二酸、烟酸、苹果酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、葡糖酸、琥珀酸、苯甲酸、甲磺酸和对甲苯磺酸中的一种或几种的组合，所述多元酸的酸式盐包括硫酸氢盐、碳酸氢盐和磷酸氢盐中的一种或几种的组合，所述缓冲对包括甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸二氢钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、Tri S-盐酸、Tricine-氢氧化钠、硼酸-硼砂、甘氨酸-氢氧化钠和碳酸钠-碳酸氢钠中的一种或几种的组合；更优选地，所述PH值调节剂为盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、Tris-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春有，王冬明，刘湘连，甘朝，
申请(专利权)人：北京东方华辉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：