本发明专利技术属于细胞技术领域。本发明专利技术公开一种新型成体干细胞、其筛选方法、试剂盒及其用途，特别是涉及一种从啮齿动物、人类或其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系样品中通过化疗药物联合细胞标记筛选获得的干细胞群。此外，本发明专利技术也公开一种从混合细胞群中筛选、识别干细胞的方法及试剂盒，该方法和试剂盒特异性强、简便快捷，实用有效的优点。本发明专利技术公开的新型干细胞、筛选方法及试剂盒有益于临床、基础与应用研究、治疗、组织工程、药物筛选、修复和再生失去功能的病变组织或器官中的应用，前景广泛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞
，具体而言，涉及一种新型成体干细胞、其筛选方法、试剂盒及其用途，特别是涉及通过化疗药物联合细胞标记的方法从啮齿动物、人类或其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系样品中筛选获得的干细胞，更具体地，涉及采用化疗药物预先对细胞群进行处理，清除其中的增殖性细胞群，进而筛选、富集和激活其中的干细胞群，之后，采用可以标记干细胞的标记对其和或子代进行识别的筛选方法，特别地，涉及一种用于从混合细胞群中筛选和标记新型成体干细胞的试剂盒，筛选的新型成体干细胞在临床、基础与应用研究、治疗、组织工程、药物筛选、修复和再生失去功能的病变组织或器官中的应用。技术背景众所周知，干细胞具有下述特征1)长期的自我更新能力；2)能够产生高度分化的其它种类细胞；3)本身处于未分化状态；4) 一般处于慢周期或静息状态；5)组织中处于相应的小生境(niches)内。 干细胞包括胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和成体干细胞(Adult Stem Cells,ASCs),胚胎干细胞是全能性的,在理论上于体内可以再生身体内几乎任意组织，但由于其一方面在获取的伦理、道德等方面遇到了问题，另一方面其在应用上遇到了较为严重的问题，例如移植的胚胎干细胞可控性差，有生长为肿瘤的风险，并且其在移植受体后将会受到受体免疫系统的排斥等等，从而限制了其应用。鉴于胚胎干细胞研究及应用所遇到的上述问题，科学家期望通过核编程的方式让成体细胞能够回到类胚胎干细胞的状态，经过几十年的研究，终于，在2006年日本科学家山中伸弥(YamanakaS, Cell, 2006126 (4) :663-676,日本专利 2008-131577)采用四个诱导因子0ct4、nanog、sox2等导入正常人成纤维细胞内，成功重编程其为类胚胎干细胞，被称为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs),该细胞具有类似人类胚胎干细胞的特性，它虽然与胚胎干细胞相似，具有能分化成生物体内所有组织的潜力，但是Lowry 和 Plath 发现(Lowry 等，Cell Stem Cell, 2009. 5 (I) :111-123),当进行分子标签比较的时候，胚胎干细胞中某些基因的表达明显与iPS细胞不同，与胚胎干细胞相比，iPS细胞研究仍有问题亟待解决，例如iPSCs具更高基因畸变频率(Loring等，Cell Stem Cell,2011.8(1) :106-118)、致瘤性风险、编程效率低等等需要克服，因而，尽管研究人员取得了令人印象深刻的进展，要把细胞再编程用于治疗疾病还需要更多一些突破。成体干细胞是另外一类具有修复、再生、替代能力的未分化细胞类型，通常位于特定的小生境内，在受到外界损伤后，其会动员或者产生新的干细胞，通过增殖、分化的方式形成新的功能细胞，从而调节组织和器官细胞数量保持动态平衡。成体干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞得以发现。造血干细胞是目前研究的最为详尽的成体干细胞之一，在过去近40年里一直是干细胞领域研究的主题，它们在体内进行自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化为所有的造血成份，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓得以恢复。成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用先决条件和最关键条件之一是对干/祖细胞的有效识别、筛选分离。最近越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成熟组织(Moore KA, Science, 2006. 311(5769) :1880-1885)，并且很可能是由处于静息态(细胞周期外且低代谢状态)和激活(细胞周期内且不能保留DNA标记)态的干细胞共存(Li等，Science, 2010. 327(5965) :542-545)，但从成体中分离干细胞仍是极具挑战性的任务，一方面在于其数量较少且更难于定位、筛选分离各种组织特异性干细胞，另外一方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进行识别。当前，主要有以下现有技术公开了如何得到相关的成体干细胞I)采用分子标志物筛选候选的干细胞，例如Thy-l1 或FLK2_Lineage_Sca-l+c-Kit+ 分选造血干细胞群(Christemsen JL 等，PNAS, 2001. 98 14541-14546 ；Uchida N 等，Experimental hematology,1996. 24 :649-659)，用 CD14.免疫磁性分离的方法从外周血筛选新的干细胞群(PCT/055950干细胞的提纯、识别及用途)用 a 6bri10G7dim(LiA 等，PNAS, 1998. 95(7) :3902-3907 ;Tani H 等，PNAS，2000. 97 (20)10960-10965 ；Lavker RM 等，PNAS，2000. 97 (25) :13473-13475)识别人类、啮齿动物来源的 上皮干细胞，但其有效性还有待进一步证实；2)以其他技术联合分子标记进行干细胞的筛选、富集比如公开号为CN108677A的一种干细胞靶向定位富集的方法，采用针对干细胞表面标志性抗原的特异性抗体与干细胞结合，再标记上免疫磁珠，移植后通过两个异性磁极将干细胞富集于靶组织内。Azuma等研究小组者采用机械或酶消化分离后结合已知分子标志物的方法，希望从成体组织中直接分离出干/祖细胞，从而对其进行鉴别及后续的功能研究(AzumaH等，Hepatology,2003.37(6) :1385-1389 ；ffright N 等，Biochem Biophys Res Commun,2008. 366(2)367-372)。通过小鼠遗传学标志谱系试验等实验，结合所发现的分子标志物，例如Musashi-1、Lgr5 等提供了鉴定干细胞的可能(Barker N 等,Nature, 2007. 449 (7165)1003-1007 ；Haegebarth A 等，Am J Pathol, 2009. 174(3) :715-721)，然而它们的有效性还有待进一步证实。不足之处是，磁珠标记可能会影响细胞活力，而酶消化作用时间又较长，富集后细胞活力不高，且这些分离的细胞群并不是同质类型的，而是由许多不同分化状态或增殖能力的混合细胞群组成，非常不纯。3)侧群筛选法(side population, SP)，分化程度较低的干/祖细胞通常表达一些ATP结合转运蛋白(ATP-binding cassette，ABC)，细胞常利用ATP能量把外来的有毒物质从细胞内排出，以达到保护自身的目的，早期Goodell等(Goodell等，J ExpMed, 1996. 183(4) =1796-1806)的研究发现，当用Hoechst33342对骨髓细胞进行染色后，造血干细胞具有很强的排出染液的能力，被称为侧群细胞。最近，Wulff等(Wulff等，Haematologica, 2003. 88 (4) :368-378)从小鼠肝内分离到一群 SP 细胞，CD45 丨或 CD45-细胞亚群，其所占的百分比为1%，体外培养均可产生肝系和造血系起源的克隆，类似的研究结果在人本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型干细胞，其特征在于：干细胞群来源于啮齿动物、人及其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体样品组织、细胞系，通过化疗药物联合细胞标记筛选而获得，其中该新型干细胞群可长期保留细胞标记。
【技术特征摘要】
1.一种新型干细胞，其特征在于干细胞群来源于啮齿动物、人及其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体样品组织、细胞系，通过化疗药物联合细胞标记筛选而获得，其中该新型干细胞群可长期保留细胞标记。2.根据权利要求I所述的一种筛选新型成体干细胞的方法，其特征在于，所述筛选、识别方法具有通用性，包括 采用化疗药物对细胞群中的成体干细胞进行筛选，之后再采用细胞标记对筛选后的干细胞群进行识别的步骤， 所述化疗药物预先加入所述细胞群中，直接清除其中的增殖性细胞群，从而筛选、富集其中的干细胞群， 所述干细胞群经耐受性筛选后激活进入细胞周期，之后，加入细胞标记对筛选后激活的所述干细胞群和或其子代进行识别， 其中，所述化疗药物选择具有清除增殖性细胞并激活干细胞群作用的试剂或物质，其中，包括已知的抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合一种或两种以上的组合，或选择以所述抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物任一一种的组合，其中，所述使用的化疗药物的浓度约lmg/kg-100mg/kg细胞重量，且所述化疗药物作用细胞群的时间范围为O. lh-72h，或选择使用所述的化疗药物的浓度约10mg/kg-50mg/kg细胞重量，且所述化疗药物作用细胞群的时间为O. 5h_36h。其中，所述标记细胞的标记选择BrdU、氣标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基_2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或细胞系或其子代的任一分子或物质，其中，所述使用的标记浓度约O. lmg/kg-15mg/kg细胞重量，所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为O. 01h-96h,或者,所述使用的标记浓度约O. 5mg/kg-10mg/kg细胞重量,所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为O. 05h-72h。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标记能够识别经耐受筛选的干细胞和或其子代的个数为一个或两个以上，其中，干细胞和或其子代可长期保留标记。4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述干细胞群和或其子代源自啮齿动物、人类或其他哺乳动物活检/离体的正常肝脏组织、肾脏组织、心脏组织、胰腺组织、肠组织、表皮组织、卵巢组织、睾丸组织、神经组织、胃组织、肺组织、乳腺组织、脂肪组织、肌肉组织、甲状腺、间充质、脾脏组织、骨髓组织、外周血、脐带血、经血、胎盘、牙组织、眼组织和脑组织中的一种或两种以上所组成的组中。5.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述筛选分离的干细胞群和或其子代源自介于正常与...
【专利技术属性】
技术研发人员：李福生，卢磊磊，卢淼淼，卢晶晶，
申请(专利权)人：李福生，卢磊磊，
类型：发明
国别省市：
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