一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括人脐带间充质干细胞的原代分离与培养和冻干粉的制备及活性检测两个步骤，在冻干粉中加入水剂进行溶解即可得到可使用的产品，可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。本发明专利技术采用此种工艺制备的冻干粉含有多种干细胞所分泌的细胞因子；采用超滤浓缩及冷冻干燥工艺，能是细胞因子的活性得到最大化的保存，且这种剂型方便产品的储存和使用；在美容及皮肤修护领域使用，可修复表皮及基底层受损的皮肤细胞，达到皮肤美容的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞因子
，具体为一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用。
技术介绍
干细胞是一种具有多向分化潜能及无限自我更新复制能力的细胞，在一定条件下，可分化为特定的组织。干细胞在生长、增殖、分化过程中会向胞外分泌促进细胞生长及调控周围环境的细胞因子等活性物质。哺乳动物的干细胞在培养过程中，细胞会向外分泌大量的皮肤修复因子和伤口愈合因子等活性物质，进入培养后的细胞培养液中。间充质干细胞具有自我复制能力和多向分化潜能，并有造血支持和促进干细胞植入、免疫调节能力；其多向分化潜能表现为，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、神经、肌肉、肝脏、内皮等多种组织和细胞，特别是具有分化为成纤维细胞(皮肤真皮层的主要构成细胞)和表皮细胞的能力。将间充质干细胞用于美容及皮肤修复领域，已经成为近些年利用再生医学技术进行美容的研究热点，常见的使用形式主要有：干细胞皮肤注射美容、干细胞培养液直接使用、干细胞条件培养液制备成冻干粉，再应用到皮肤美容中。直接注射干细胞，对细胞的质量要求较高，且需要供体的细胞，注射的细胞不一定能完全成活；直接使用干细胞条件培养液，可以减少在反复操作过程中，条件培养液有效成分的流失，但是干细胞分泌的细胞因子在常温下或温度变化的条件下，会发生部分活性丧失，不能达到预期的效果；干细胞条件培养液冻干粉的使用，可以在体外进行干细胞的扩大培养，并进行细胞的条件诱导处理，以使细胞可以分泌更多有效的细胞因子，而且冻干工艺的使用，能稳定的保存细胞因子的活性，便于储存和运输，且在使用时，只需要用相应水剂溶解，便于操作。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题在于提供一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用，以解决上述
技术介绍
中的缺点。本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用，选用人体免疫源性最低、干细胞性能最强、易于获取的脐带组织，经体外干细胞分离与扩大培养，得到纯度较高的干细胞。再将干细胞进行工厂化放大培养，富集细胞培养液，经培养液的浓缩、蛋白含量测定、冻干、质检，得到成品——富含多种细胞因子的冻干粉。该冻干粉可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，其步骤如下：步骤一：人脐带间充质干细胞的原代分离与培养1)将接收的临床检测合格的脐带组织放置在含50-100ml生理盐水的无菌采集瓶中，密封保存。使用保温箱(含冰袋运输)，送回无菌实验室。2)在净化工作台内，从采集瓶中取出脐带，放入培养皿中，测量脐带长度并做记录。测量完毕，将脐带转入另一培养皿中，用长柄手术剪将脐带剪成长3-4cm小段，用生理盐水重复清洗3-5次，去除血渍，达到清澈。3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用有齿直镊撕下两条实心动脉和外膜，其余为华通氏胶即位于羊膜与血管之间的白色结缔组织。用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2-3次。所述静脉和动脉血管的去除，是为了避免所分离到的细胞含有血管细胞的成分，影响细胞的纯度。4)将获得的胶体转移至另一平皿中，用眼科弯剪将胶体剪成约1mm3×1mm3组织块，收集至50ml离心管中。用10ml组织消化液，37℃恒温震荡消化30-60min。消化完成后，再使用10ml细胞消化液，继续37℃恒温震荡消化15-30min。直至华通氏胶全部被消化(肉眼看不见大的组织块时即可)。用10ml细胞培养液中止消化。并轻轻吹打消化的组织块50-100下，随后加入20ml生理盐水稀释，吹匀，旋紧离心管盖，放入离心机1000rpm/min，离心10-20min。5)离心完毕，弃上清，将4-10ml细胞培养液加入离心管中，轻轻吹打细胞液体10-20下，使细胞成单细胞悬液，用10ul微量移液器在离心管中吸取10ul含单细胞悬液的液体，加入一次性计数板上，用电子计数仪计数。按照计数结果，以3-5*105/瓶的密度，将离心管内单细胞悬液接种至一次性25cm2培养瓶中。6)将培养瓶口、瓶盖过火后盖上盖子，将细胞轻轻摇匀，做好标记放入二氧化碳培养箱，水平放置。72h后换液，以后每隔48h换液一次。培养至第7-10天，细胞克隆团的面积达到80％，消化收获细胞。进行传代培养。步骤二：人脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定1)取P20代以内细胞，胰酶消化计数后，按1×105-1×106/管的密度接种至9个1.5mlEP管中，每管加入1mlPBS，混匀细胞悬液，800-1000rpm/min，离心5-10分钟。离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl含2％FBS的PBS重悬细胞，并在避光条件下分别加入以下流式抗体2-5μl：PEanti-humanCD19、FITCanti-humanCD73、PEAnti-HumanCD90、PEanti-humanCD105、FITCAnti-HumanCD14、PEanti-humanCD34、PEanti-humanCD45、FITCAnti-HumanHLA-DR。2)抗体加入后用200μl微量移液器轻轻混匀，注意不要产生气泡，室温避光孵育30-60min。3)孵育结束后，用2％FBS的PBS洗涤细胞两次，每次用1ml。800rpm/min，离心5-10分钟。离心后用300μl2％FBS的PBS重悬细胞后上流式仪检测。步骤三：细胞因子生产与蛋白浓度的检测细胞因子的生产，收集培养的细胞上清液,先采用0.22μm滤膜进行过滤，然后通过30KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过3KD超滤膜，收集截留液，即为生物活性因子冻干粉原液。蛋白浓度检测，即采用BCA蛋白浓度测定法对生物活性因子冻干粉原液总蛋白浓度进行测定。标准为：蛋白浓度≥0.8mg/ml。步骤四：冻干粉的制备及活性检测1)称取0.1％-1％的右旋糖酐，用配制量10％体积的纯化水先将右旋糖酐40溶解，需加热煮沸，至完全澄清。2)另取一烧杯，称取5％-15％的甘露醇，溶解，需加热到60-70℃，至澄清，将右旋糖酐及甘露醇混合，再加入0.1％-1％的海藻糖，搅拌均匀至澄清。3)待液体放至室温，加入因子浓缩液，最终用纯化水定容至10L，搅拌均匀至澄清即可。4)液体过滤：溶解均匀的液体用0.22-0.45μm的滤器进行过滤，滤液收集在灭过菌的容器中。5)液体分装：过滤后的液体按照每支西林瓶(7mL)装样2mL进行分装，分装结束后半加胶塞(分装所用的器皿都要经过121℃，30min，0.1MPa的高温高压进行灭菌，并且烘干。6)冻干：分装后冷冻干燥，得到冻干粉常温贮存备用。7)活性检测：活性检测主要以冻干粉的抗氧化活性检测为主。以人成纤维细胞作为检测细胞，以正常培养液作为阴性对照，维生素C作为阳性对照，冻干粉的培养液溶液作为样品，用qRT-PCR方法检测Mn-SOD基因在成纤维细胞上的表达量变化情况。本专利技术中，所述组织消化液，可将组织间的纤维连接直接破坏，使组织块得到最大程度的分散，便于细胞的分离。本专利技术中，所述细胞因子表达的检测，应该满足细胞经流式仪检测检测≥95％，则为表达CD105、CD73和CD90；经流式仪检测检测≤2％则为不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括人脐带间充质干细胞的原代分离与培养和冻干粉的制备及活性检测两个步骤，其特征是：步骤一；所述人脐带间充质干细胞的原代分离与培养分为以下步骤：1)检测合格的脐带在通过初步的培养和清洗后，使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用有齿直镊撕下两条实心动脉和外膜，获得华通氏胶并用生理盐水冲洗所述华通氏胶，重复清洗2‑3次；2)将所述华通氏胶和细胞消化液混合至离心管中，待消化完后于离心机中进行离心；离心后取单细胞悬液接种至培养瓶中进行传代培养；3)将培养瓶中P20代内的细胞进行离心、孵化、二次离心和超滤浓缩后得到因子浓缩液；步骤二；所述冻干粉的制备分为以下步骤：1)称取0.1％‑1％的右旋糖酐，用配制量10％体积的纯化水先将右旋糖酐‑40溶解；2)另取一烧杯，称取5％‑15％的甘露醇，溶解(需加热到60‑70℃，至澄清)，将右旋糖酐及甘露醇混合，再加入0.1％‑1％的海藻糖，搅拌均匀至澄清；3)待液体放至室温，加入步骤一中3)中所述因子浓缩液，最终用纯化水定容至10L，搅拌均匀至澄清即可；4)溶解均匀的液体用0.22μm的滤器进行过滤，滤液收集在灭过菌的容器中；5)过滤后的液体按照每支7mL的西林瓶装样2mL进行分装，分装结束后半加胶塞；6)冻干：分装后冷冻干燥，得到冻干粉常温贮存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括人脐带间充质干细胞的原代分离与培养和冻干粉的制备及活性检测两个步骤，其特征是：步骤一；所述人脐带间充质干细胞的原代分离与培养分为以下步骤：1)检测合格的脐带在通过初步的培养和清洗后，使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用有齿直镊撕下两条实心动脉和外膜，获得华通氏胶并用生理盐水冲洗所述华通氏胶，重复清洗2-3次；2)将所述华通氏胶和细胞消化液混合至离心管中，待消化完后于离心机中进行离心；离心后取单细胞悬液接种至培养瓶中进行传代培养；3)将培养瓶中P20代内的细胞进行离心、孵化、二次离心和超滤浓缩后得到因子浓缩液；步骤二；所述冻干粉的制备分为以下步骤：1)称取0.1％-1％的右旋糖酐，用配制量10％体积的纯化水先将右旋糖酐-40溶解；2)另取一烧杯，称取5％-15％的甘露醇，溶解(需加热到60-70℃，至澄清)，将右旋糖酐及甘露醇混合，再加入0.1％-1％的海藻糖，搅拌均匀至澄清；3)待液体放至室温，加入步骤一中3)中所述因子浓缩液，最终用纯化水定容至10L，搅拌均匀至澄清即可；4)溶解均匀的液体用...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓宁，明磊国，徐佳洁，杨晓蕾，张勇杰，
申请(专利权)人：东莞自然衡健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44