本发明专利技术涉及一种间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）来源胞外体（Exosomes）制备、纯化的生产工艺及该胞外体作为非细胞治疗手段在治疗急性肺损伤中的应用。该胞外体来源的MSCs属贴壁粘附型干细胞，其制备和纯化工艺的特色在于：（1）制备MSCs条件培养基时特别添加甲状旁腺激素；（2）不连续Ficoll密度梯度法与免疫磁珠法结合分离纯化获得该胞外体。经大鼠急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）模型实验证实该胞外体可用于ALI的治疗，为实现替代干细胞治疗的非干细胞治疗途径奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞研究，属表观遗传学、细胞生物学及分子生物学领域，具体涉及一种间充质干细胞（MSCs）所分泌和释放的胞外体（Exosomes）的改良制备工艺，并利用其归巢机制，研究其在治疗急性肺损伤（ALI）中的作用机制。
技术介绍
ALI是临床重症患者发生急性呼吸衰竭的主要原因，其发病机制复杂且未能完全阐明，病情易发生急骤变化，死亡率仍高于40%以上。MSCs是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成为多种功能细胞，是生物体保持形态与功能正常的重要基础，与生物体的生长发育、衰老、损伤修复和疾病均有着密切的关系。经研究证实，MSCs植入损伤肺部，虽可改善炎症因子等介导的炎症反应、减少死亡率，但鉴于MSCs目前尚无特异性的表面标记物，取材来源、培养条件的差异和培养代数的不同是否会引起MSCs的性质、功能的不同，较难长期保存和运输，存在治疗细胞的非治疗目的分化（成骨，成软骨细胞及其他分化），以及生物安全性隐患（肿瘤，基因污染，感染），使得ALI/ARDS的治疗仍未取得突破，寻找非干细胞的“干细胞”治疗途径日益成为该领域的研究焦点。以往的研究提出干细胞治疗的机制有两种假说，即“分化替代”假说和“细胞因子旁分泌”假说。其中，“分化替代”假说认为，移植干细胞可分化为如心肌细胞、血管内皮细胞、成骨细胞等受损伤的组织细胞，从而发挥治疗作用。针对这一假说，虽有一定的实验证据，但尚不能解释干细胞的全部治疗作用及机制。随后有人又提出干细胞的“细胞因子旁分泌”假说，认为一方面干细胞可分泌各种细胞因子，作用于受损组织各细胞，抑制其凋亡，促进其生成，激活自身干细胞发挥作用，同时损伤部位微环境中也可分泌干细胞生长与分化因子等活性物质作用于治疗源干细胞，从而发挥治疗作用，但是该假说由于发现的细胞因子种类和含量均不能完全解释干细胞治疗的作用机制，因此，也不能被完全认可。Exosomes是由多囊泡体(multivesicle body，MVB) 内吞，包裹细胞内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性物质，再由内吞小体出泡产生的一种亚细胞结构的复合信息体，被认为是一种介导细胞间信息传递的重要“内分泌”机制。与细胞分泌的其他囊泡相比，Exosomes具有更清晰的生物学特性。 Exosomes可保护其所携带的酶和化学物质不被降解；离体条件下可在-20℃保存6个月，无潜在毒性，且生物化学活性不受影响；其表面的复合分子为其靶向特定组织及微环境提供了一个潜在的归巢机制；可使治疗性的蛋白质、RNA通过吞噬、食菌、膜融合的方式进入受损细胞；既具有MSCs类似的生物学功能，又具有不同于细胞的众多优点，有足够的潜力参与广泛的生物化学及细胞活性反应，。利用动物模型研究MSCs来源Exosomes的应用已有一些报道，Lai等研究发现人类胚胎干细胞(ESC)来源的MSCs培养上清中提纯得到的Exosomes，能减少小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中的心肌梗死面积，对治疗心肌缺血再灌注损伤有显著的疗效；骨髓MSCs分泌的Exosomes在急性肾小管损伤的组织中通过mRNA水平转移激活幸存肾小管细胞中的增殖程序，抑制其凋亡达到修复损伤的作用；Lee等研究发现MSCs来源Exosomes能够抑制人肺动脉高压内皮细胞的Stat3信号，进而影响血管重塑。但在治疗急性肺损伤方面，MSCs来源Exosomes的应用尚未见报道，Exosomes的深入研究无疑为ALI/ARDS的治疗提供了广阔的前景。 目前，Exosomes的制备技术主要依靠传统超高速密度梯度离心法，需要大型的超高速离心机及重水等特殊原料，但并不能将Exosomes与其它的小囊泡结构或大的蛋白聚集物区分开来，且由于离心机所用的专用转头及离心管容积的限制，无法大量制备，极大的限制了其应用。生物膜分离技术虽对设备及材料要求简单、步骤简化，大大缩短了制备时间，但仍未解决关键问题。本专利根据Exosomes结构和功能的特性，通过工艺的改良，一方面添加甲状旁腺激素增加体外培养MSCs中Exosomes的释放量，另一方面解决了上述关键问题，保证了Exosomes的高纯度与生物学活性，达到“低投入、高产出”的目的。并且我们认为Exosomes可进行人工或半人工的制备，既保留了与干细胞相同的生物学特性与功能，又可对其进行靶向加工，突破MSCs的局限性，制成更加具有临床应用前景且能够替代干细胞治疗的“Super Exosomes”。
技术实现思路
本专利技术专利主要目的是提供一种MSCs来源Exosomes的改良制备工艺，利用Exosomes可发挥MSCs类似的生物学功能，且具有众多优于细胞的特点，应用于ALI/ARDS的治疗，揭示MSCs治疗呼吸系统疾病的核心机制，进而为实现替代干细胞治疗的非干细胞治疗途径提供有力的技术基础。本专利技术专利的要点之一：该胞外体既不分裂增殖，也不进行代谢，可发挥类似干细胞的功能作用，是干细胞发挥治疗作用的核心机制，安全性高，抑郁保存，具有广大的临床应用前景。本专利技术专利的要点之二：提高该胞外体的提纯率，保证其生物活性的维持，从而进行该胞外体治疗目的性的规模化生产，本专利技术专利公开该胞外体生产工艺，为其作为新的非细胞治疗手段进入临床应用提供技术支持。本专利技术专利提供一种间充质干细胞来源的胞外体，该胞外体为间充质干细胞分泌的亚细胞结构信息复合体，胞膜完整，携带其源细胞胞质内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性成分，除具有源细胞表面标记物CD29、CD44、CD105外，还特异性表达CD63、CD81。其中，所述胞外体的来源的间充质干细胞包括不同种属及同一种属不同部位，具体为人脐带血及骨髓间充质干细胞，鼠骨髓间充质干细胞。本专利技术专利还提供了一种间充质干细胞来源的胞外体生产工艺，制备该胞外体条件培养基，取生长良好的3-50代间充质干细胞，当细胞融合率达70%-80%时，弃去上清，PBS清洗后更换无血清培养基继续培养48h；无血清培养基中添加甲状旁腺激素1ng/ml。其中，所述的生产工艺包括初步的分离纯化步骤，具体为使用不连续Ficoll密度梯度离心法：（1） Ficoll—甘油分离液的配制：①将2g Ficoll干粉溶解于5ml蒸馏水中，再与40ml 60%甘油充分混合。取混合液22ml，蒸馏水最终定容至32ml，混匀后，待温度冷却至4℃时，使用比重计测得密度1.125g/ml；②将2g Ficoll干粉溶解于4ml蒸馏水中，再与26ml 80%甘油充分混匀，待温度冷却至4℃时，使用比重计测得密度1.206g/m；（2）50ml离心管中底层铺设1.206g/ml Ficoll—甘油分离液5ml，上层铺设1.125g/ml Ficoll—甘油分离液5ml，静置待稳定。收集条件培养上清液，3000rpm低温（4℃）离心10min，经0.2μm无菌滤膜过滤后即为粗提的Exosomes，缓慢将Exosomes的粗提液40ml移入已铺设好分离液的离心管中，11500g低温离心30min，吸出两本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从间充质干细胞中提取的胞外体，其特征在于：所述胞外体为间充质干细胞分泌的亚细胞结构信息复合体，胞膜完整，携带其源细胞胞质内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性成分，除具有源细胞表面标记物CD29、CD44、CD105外，还特异性表达CD63、CD81。
【技术特征摘要】
1.一种从间充质干细胞中提取的胞外体，其特征在于：所述胞外体为间充质干细胞分泌的亚细胞结构信息复合体，胞膜完整，携带其源细胞胞质内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性成分，除具有源细胞表面标记物CD29、CD44、CD105外，还特异性表达CD63、CD81。
2.根据权利要求1所述的胞外体，其特征在于：所述胞外体的来源的间充质干细胞包括不同种属及同一种属不同部位，具体为人脐带血及骨髓间充质干细胞，鼠骨髓间充质干细胞。
3.权利要求1—2所述胞外体的制备方法，其步骤包括：(1)制备胞外体条件培养基；(2) 使用不连续Ficoll密度梯度离心法与免疫磁珠法配伍高效提纯胞外体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述胞外体条件培养基的制备方法为：取生长...
【专利技术属性】
技术研发人员：田新瑞，周楠，牛勃，张霆，陈彦，王建华，徐文婧，季成，杨利军，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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