一种重组HEK‑293T细胞及其分泌的抗寨卡病毒融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种重组HEK‑293T细胞，其特征在于，该重组HEK‑293T细胞是以HEK‑293T细胞为宿主转染外源融合基因获得，其中所述的外源融合基因的核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明专利技术所述重组HEK‑293T细胞可分泌抗寨卡病毒的融合蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及引入外来遗传物质而修饰的细胞，具体涉及重组的HEK-293T细胞。
技术介绍
寨卡病毒(Zikavirus)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)病毒，主要通过蚊虫叮咬传播、性接触传播，此外病毒可以通过胎盘。1947年病毒学家在乌干达发现ZIKA病毒，患者主要表现为发热、斑丘疹及关节酸痛，之后仅表现为零星发病和小规模流行。直到2007年在南太平洋的Yap岛爆发流行，随后在非洲、东南亚及南美洲相继出现在卡病毒感染病例。中国国家卫生计生委2016年2月9日通报，确诊一例输入性Zika病毒感染病例，截至目前共有10例输入性Zika病毒感染病例。临床研究证实Zika病毒能够通过胎盘，导致胎儿出现小头症。GuillaumeCarteaux报道了1例成年人中Zika病毒感染引起的脑膜脑炎。Zika病毒感染成为严重的世界性公共卫生问题，同时给爆发疫情的国家和地区造成严重经济损失。世界银行最新公布的数据显示，在Zika病毒感染发生国，或疫情预计会大面积爆发的国家或地区，当地的国际游客数量料将骤减，其旅游业将因此损失639亿美元。我国地缘辽阔，夏季蚊虫滋生，为该疾病的传播创造了有利条件。Zika病毒核酸为单股正链RNA，长10.8kb，编码一个前体蛋白，经病毒和宿主蛋白酶切割成3个结构蛋白(C、prM/M和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。Zika病毒与登革热病毒同属于黄病毒科病毒，二者的核酸和蛋白同源性较高，目前国内外对登革热病毒研究报道较多，Beth-AnnG.Coller等采用昆虫细胞表达登革热E蛋白，接种小鼠和非人灵长类动物均表现出较好的免疫原性，攻毒试验表明该蛋白具有较好保护力，具有成为登革热病毒亚单位疫苗的潜力。此外，Zika病毒非结构蛋白，例如NS1、NS3和NS5等在病毒黏附、侵入和复制等过程中发挥重要作用。Zika病毒感染已经成为影响人们健康的重要公共卫生因素，该疾病没有特效治疗方法，且尚没有商品化的疫苗，E蛋白结构域Ⅲ被认为是研发Zika疫苗的最佳候选蛋白，KimMY和PoddarA等人研究均表明登革热病毒E蛋白结构域Ⅲ能刺激动物机体产生较高滴度保护性抗体，具有制备登革热病毒重组亚单位疫苗的潜力(KimMY,KimBY,OhSM,ReljicR,JangYS,YangMS.OralimmunisationofmicewithtransgenicricecalliexpressingcholeratoxinBsubunitfusedtoconsensusdenguecEDIIIantigeninducesantibodiestoallfourdengueserotypes.PlantMolBiol.2016Oct；92(3):347-56.PoddarA,RamasamyV,ShuklaR,RajpootRK,AroraU,JainSK,SwaminathanS,KhannaN.Virus-likeparticlesderivedfromPichiapastoris-expresseddenguevirustype1glycoproteinelicithomotypicvirus-neutralizingenvelopedomainIII-directedantibodies.BMCBiotechnol.2016Jun14；16(1):50.)。文献报道表明，带有IgG1Fc标签的融合蛋白可增强融合蛋白的免疫原性，其原理可能是延长了融合蛋白的半衰期或者增加了表达FcR抗原递呈细胞的摄入。另外，人IgG1Fc片段是人体自身成分，作为疫苗成分时发生免疫排异的风险较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种重组HEK-293T细胞，该重组HEK-293T细胞可稳定分泌表达抗寨卡病毒的融合蛋白。本专利技术解决上述问题的技术方案如下：一种重组HEK-293T细胞，其特征在于，该重组HEK-293T细胞是以HEK-293T细胞为宿主转染外源融合基因获得，其中所述的外源融合基因的核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。上述重组HEK-293T细胞由如下方法制得：(1)分别从GenBank中获取ZIKA病毒E蛋白结构域III(录入号为KU955594.1)和人IgG1Fc(录入号为JN222933.1)的核苷酸序列，并将二者采用柔性肽(GGGS)3连接，然后进行密码子优化，得到如SEQ.ID.NO.1所示的融合基因；将所得到的融合基因的起始端和终止端密码子分别进行酶切，然后克隆至载体pMD19-T中，得到重组载体命pMD19-ZDIII-hFc；(2)先取FUGW质粒用PacⅠ酶切后补平再用BamHⅠ酶切回收载体大片段，再取pCDNA3.0质粒先用BglⅡ酶切后补平再用BamHⅠ酶切后回收CMV启动子，然后用Rocheligationkit将所回收的载体大片段和CMV启动子连接后得到慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP；(3)将慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP双酶切回收大片段，再将pMD19-ZDIII-hFc双酶切回收核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的融合基因ZDⅢ-hFc，然后将所回收的大片段与融合基因ZDⅢ-hFc在T4DNA连接酶作用下连接，转化stab3感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取得到慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc；(4)将所述慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDⅢ-hFc与慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞，即得重组HEK-293T细胞。所述的重组HEK-293T细胞可稳定分泌表达寨卡病毒与人源IgG1Fc融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的融合蛋白具有抗寨卡病毒生物活性。本专利技术具有以下有益效果：1、现有技术大多采用原核表达或酵母表达蛋白，上述方法制备的蛋白与天然蛋白在高级结构方法存在较大差异，本专利技术所选用的表达系统为HEK-293T细胞，得到的重组HEK-293T细胞具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；重组细胞可以用转瓶高密度发酵培养，易于大量生产。2、本专利技术在对Zika病毒基因哺乳动物细胞密码子偏嗜性基础上，首次利用慢病毒表达系统表达E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc融合蛋白，该融合蛋白中的Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc蛋白之间通过柔性肽(GGGS)3连接，有利于后期纯化。3、本专利技术的重组表达细胞系可以利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表达，可以降低疫苗生产成本；4、本专利技术抗原表达量高，利用普通细胞培养瓶皿培养，产量可达110mg/L。附图说明图1为慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDIII-hFc构建示意图。图2为慢病毒重组载体pLV-CMV-EGFP-ZDIII-hFc酶切鉴定的电泳图，图中M为marker，1为挑选克隆。图3为Westernblot鉴定不同阳性克隆细胞中Zika病毒E蛋白结构域Ⅲ与人源IgG1Fc融合蛋白表达情况的电泳图；图中，条带本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组HEK‑293T细胞，其特征在于，该重组HEK‑293T细胞是以HEK‑293T细胞为宿主转染外源融合基因获得，其中所述的外源融合基因的核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组HEK-293T细胞，其特征在于，该重组HEK-293T细胞是以HEK-293T细胞为宿主转染外源融合基因获得，其中所述的外源融合基因的核酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种重组HEK-293T细胞，其特征在于，所述的由以下方法制得：(1)分别从GenBank中获取ZIKA病毒E蛋白结构域III和人IgG1Fc的核苷酸序列，并将二者采用柔性肽(GGGS)3连接，然后进行密码子优化，得到如SEQ.ID.NO.1所示的融合基因；将所得到的融合基因的起始端和终止端密码子分别进行酶切，然后克隆至载体pMD19-T中，得到重组载体命pMD19-ZDIII-hFc；(2)先取FUGW质粒用PacⅠ酶切后补平再用BamHⅠ酶切回收载体大片段，再取pCDNA3.0质粒先用BglⅡ酶切后补平再用BamHⅠ酶切后回收CMV启动子，然后用Ro...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红卫，刘军，顾为望，李静静，李青青，仇珍珍，颜仁和，王升尧，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44