本发明专利技术公开了一种负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料及其制备方法。选择具有良好生物相容性和传递效率的季铵化壳聚糖作为siRNA载体材料，与可抑制瘢痕化相关因子表达的siRNA络合形成季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子；再将该复合粒子通过物理吸附作用负载到胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架，最终得到的皮肤再生材料可利用复合粒子在皮肤缺损创面的原位转染来下调皮肤修复过程中瘢痕化相关因子的表达水平，在有效促进缺损皮肤再生修复的同时抑制胶原过度沉积和瘢痕化。本发明专利技术所制备的皮肤再生材料具有优异的创面修复及减弱瘢痕的能力，可广泛应用于全层皮肤缺损的修复与再生，具有良好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种负载基因活性物质的皮肤再生材料及其制备方法，具体说涉及一种负载季铵化壳聚糖/SiRNA复合粒子的胶原-壳聚糖/硅橡胶皮肤再生材料及其制备方法。
技术介绍
皮肤是人体最大的器官，约占人体重量的16%。皮肤由表及里可依次分为表皮层、真皮层以及皮下组织三部分；其结构具有高度复杂性，包括多种细胞和胶原、弾性蛋白、糖蛋白或蛋白多糖等生物大分子，以及氨基酸、葡萄糖、维生素、无机盐等小分子。由于日常生活中大面积暴露于外部坏境中，皮肤极易因烧伤、机械创伤和慢性疾病(如糖尿病)等导致缺损，严重影响人类生命和生存质量。目前，自体皮移植仍是临床上治疗皮肤缺损的最佳方法，然而对于大面积缺损患者往往存在供皮区不足和二次甚至多次手术的问题。近年来，基于组织工程和再生医学原理的各类皮肤再生材料逐步发展起来，成为治疗皮肤缺损的有效手段。胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架是ー类原位诱导真皮再生的皮肤再生材料，由胶原-壳聚糖三维多孔支架和硅橡胶薄膜組成。其中胶原-壳聚糖三维多孔支架起真皮再生模板作用，可有效诱导缺损组织处细胞迁移、増殖和分化，最終实现真皮组织的再生。硅橡胶薄膜则起临时表皮层的作用，可有效防止水分丧失和抵御细菌入侵，对创面实施临时保护。该双层支架所采用原料为胶原和壳聚糖，均为生物相容性好、免疫原性低和可生物降解的材料。经证明，该皮肤再生材料可实现创伤和烧伤导致的全层皮肤缺损的修复与再生。然而，经该材料再生修复的皮肤组织仍然存在一定的瘢痕化问题，影响了再生皮肤组织的生理功能。瘢痕化是人体创伤修复过程中应激反应的产物，其本质是细胞外基质(ECM)的合成代谢与降解代谢的失衡，进而导致细胞外基质(主要为胶原)的过量沉积。瘢痕性修复虽能恢复创面的完整性，但并不能重建皮肤原有结构和功能，易引起皮肤组织畸形和功能障碍，也可导致局部皮肤溃烂和瘙痒等问题。皮肤修复过程的瘢痕化涉及多种细胞因子的调控，其中转化生长因子β (TGF-β)是调控胶原、蛋白多糖等细胞外基质沉积，调节瘢痕形成的关键细胞因子。研究表明，适量的TGF-β有益于创面愈合，但是TGF-β，尤其是TGF-β I的过量表达却可导致瘢痕化；因此，抑制皮肤修复过程中的TGF-β I表达水平，可減少瘢痕的形成。目前，抑制TGF-β I水平的途径主要有TGF-i3 I抗体中和，6-磷酸甘露糖、核心蛋白聚糖等拮抗剂的应用，可溶性TGF-β I受体竞争TGF-β I结合位点，以及反义寡核苷酸干扰TGF-β I基因表达等。小干扰RNA(SiRNA)技术是近10年发展起来的ー种先进基因技术，它可在转录后水平和翻译水平上阻断靶基因的表达，广泛应用于基因组学、抗肿瘤和抗病毒等领域的研究。采用siRNA技术调控TGF-β I水平，可避免TGF-β I抗体的免疫原性和易失活等问题。相对于反义寡核苷酸等其他基因调控手段，siRNA技术具有高效，特异性好以及持续时间长等优点。siRNA的作用效果极大程度依赖于其传递载体，理想的siRNA载体可起到保护siRNA免受破坏和促进siRNA被细胞摄入的作用。其中，季铵化壳聚糖具有良好的生物相容性和传递效率，是ー类有效的siRNA载体材料。siRNA与其载体形成的复合粒子，可通过简单快捷的物理吸附作用负载到胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架。胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架对siRNA起到储存和缓释的作用，最終通过siRNA在皮肤缺损创面的原位转染来下调皮肤修复过程中瘢痕化相关因子(TGF-β I或其下游信号通路因子如Smad2蛋白和Smad3蛋白)的表达水平，在有效促进缺损创面再生修复的同时，抑制胶原的过度沉积，降低再生皮肤组织的瘢痕化程度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，该皮肤再生材料可广泛应用于创伤和烧伤等全层皮肤缺损，在有效诱导缺损、皮肤再生修复的同时抑制再生皮肤的瘢痕化。I.本专利技术提供的负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料，包括由胶原-壳聚糖三维多孔支架和硅橡胶薄膜构成的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架，在双层支架中吸附有季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子，其中，siRNA与胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架的质量比为I :1000—10 :1000，季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子中季铵化壳聚糖与siRNA的质量比为1:1—50:1。上述的siRNA是抑制转化生长因子β I (TGF-β I)的siRNA、抑制Smad2蛋白的siRNA或抑制Smad3蛋白的siRNA。本专利技术的负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料的制备方法，包括以下步骤 O用超纯水分别配制浓度为I一5mg/mL的季铵化壳聚糖溶液和浓度为O. I一lmg/mL的siRNA溶液；将季铵化壳聚糖溶液和siRNA溶液等体积混合，涡旋振荡均匀后静置，制得季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子； 2)用质量浓度为O.5% — 3%的こ酸溶液分别配制质量浓度为O. 1% — O. 7%的胶原溶液和质量浓度为O. 1% — O. 7%的壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中使得壳聚糖和胶原的质量比为1:9一5:5，搅拌均匀及真空脱泡，得到胶原-壳聚糖混合溶液；将胶原-壳聚糖混合溶液注入模具中，在-10 oC一-80 °G温度下冷冻并冻干，获得胶原-壳聚糖三维多孔支架；将胶原-壳聚糖三维多孔支架在质量浓度为O. 01% — 1%的戊ニ醛溶液中交联I一48小时，反复清洗后，再次-10 oC一-80 °e温度下冷冻并冻干； 3)将医用胶黏剂以O.05—0. 5mg/cm2的量均匀涂覆在厚度为O. 05—0. 2mm的硅橡胶薄膜表面，然后将步骤2)制备好的胶原-壳聚糖三维多孔支架黏贴于涂覆胶黏剂的硅橡胶薄膜表面上，获得胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架； 4)将步骤I)的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子滴加到胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架上，其中siRNA与胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架的质量比为1:1000—10:1000 ;室温下孵化I一4小时，在-10 oC一-80 °e温度下冷冻并冻干，得到负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料。上述的医用胶黏剂是α -氰基丙烯酸酯类胶黏剂或有机硅胶黏剂。上述的SiRNA是抑制TGF-β I的siRNA、抑制Smad2蛋白的siRNA或抑制Smad3蛋白的siRNA。本专利技术的优点 本专利技术制备的负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料，其突出特点是采用天然大分子胶原蛋白作为主要原料、并添加组分壳聚糖提高交联效率和改善降解性能；通过调控冷冻干燥的參数，得到具有可控孔径和孔隙率的三维多孔支架作为真皮再生模板。选择生物性相容性好、弾性好、透气性高和透湿性可控的硅橡胶薄膜作为表皮层的模拟物，起到阻止细菌侵入和防止水分蒸发的作用，所制备的双层支架具有良好的诱导缺损真皮再生修复的性能，可广泛应用于创伤和烧伤创面的修复。针对再生修复创面的瘢痕化问题，采用生物相容性好、正电荷密度高的季铵化壳聚糖作为siRNA传递载体，制备稳定性和沉默效率高的季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子；通过改变siRNA的种类和负载量，得到可以调控瘢痕化相关因子表达水平的皮肤再生材料。该皮肤再生材料组织相容性好，可诱导各种修复细胞的迁移、増殖、分化，有效促进肉芽组织的形本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种负载季铵化壳聚糖/SiRNA复合粒子的皮肤再生材料，其特征是包括由胶原-売聚糖三维多孔支架和硅橡胶薄膜构成的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架，在双层支架中吸附有季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子，其中，siRNA与胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架的质量比为I :1000—10 :1000，季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子中季铵化壳聚糖与siRNA的质量比为 1:1—50:1。2.根据权利要求I所述的负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料，其特征是所说的siRNA是抑制转化生长因子β I的siRNA、抑制Smad2蛋白的siRNA或抑制Smad3蛋白的siRNA。3.制备权利要求书I所述的负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料的方法，其特征在于包括以下步骤 O用超纯水分别配制浓度为I一5mg/mL的季铵化壳聚糖溶液和浓度为O. I一lmg/mL的siRNA溶液；将季铵化壳聚糖溶液和siRNA溶液等体积混合，涡旋振荡均匀后静置，制得季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子； 2)用质量浓度为O.5% — 3%的こ酸溶液分别配制质量浓度为O. 1% — O. 7%的胶原溶液和质量浓度为O. 1% — O. 7%的壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液滴入胶原溶液中使得壳聚糖和胶原的质量比为1:9一5:5，搅拌均匀及真空脱泡，得到胶原-壳聚糖混合...
【专利技术属性】
技术研发人员：马列，刘幸，高长有，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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