本发明专利技术涉及驴皮成纤维细胞培养技术领域，具体是涉及一种驴皮成纤维细胞体外快速培养的方法。该方法利用胰蛋白酶和胶原蛋白酶I先后消化作用于驴皮的组织块，使相应的驴皮成纤维细胞被分离出来，进而高效快速地建立起驴皮成纤维细胞体外培养体系。本发明专利技术克服了驴皮成纤维细胞由于驴皮中含有大量胶原蛋白而不便被体外培养的难题，且仅需三天左右便可建立稳定的驴皮成纤维细胞体外培养体系，时间短，效率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及驴皮成纤维细胞培养
，具体是涉及。
技术介绍
阿胶为我国药、食两用传统中药材，系补血之上品，与人参、鹿茸并称为“滋补三宝”，享誉国内外市场。而马科动物驴的皮是生产阿胶的唯一原料。驴皮中的主要蛋白质是I型胶原蛋白，它和血清白蛋白等多肽类物质、多糖类物质及其它小分子物质构成了阿胶的主要成分。但近年来由于毛驴作为畜力的角色逐渐被机械取代，加上毛驴养殖周期长、收益慢，使我国毛驴存栏量迅速下降，因而使得市场对驴皮需求产生巨大缺口，已成为制约阿胶业发展的一大瓶颈。针对这一问题，一方面国家制定了相应的策略，鼓励并扩大了驴的养殖。另一方面，结合现代生物学的知识，来提高驴皮的利用率和开发新的阿胶生产途径也是科研上急需跟进解决的问题。这首先需要解决的问题就是要在体外高效快速的培养起驴皮成纤维细胞，以便进一步研宄驴皮成纤维细胞合成I型胶原蛋白的调控机理。细胞培养方法主要有两种:组织块法及酶消化法。酶消化法是培养上皮细胞的常用方法，但消化液的用量、消化温度及时间不好掌握，可能导致细胞极易老化、凋亡等结果，消化时间较长，细胞容易受损，解决办法是分次收集细胞，从而使实验比较繁琐。组织块法培养细胞时，有的组织块经长时间培养仅得到较少的细胞，有的甚至无细胞爬出，达不到所需细胞量。目前未见专门关于驴皮成纤维细胞体外培养的报道，而同为马属动物的马皮成纤维细胞的体外培养方法依旧采用的是传统的组织贴壁法。即剪取一块皮肤组织，75%酒精浸泡I分钟左右，再用含双抗的DPBS冲洗3遍，剔除皮肤间结缔组织后，将皮肤组织剪成Icm3左右的小块，然后将其均匀分布在培养瓶中，培养瓶倒置后加入含有10% FBS的DMEM培养液，在37.5°C、5% CO2的培养箱中倒置培养4-6h后，正置培养瓶，使培养液缓慢浸没组织块，继续培养。或是将组织块直接贴于培养皿或者培养瓶中，随后用含有10 % FBS的DMEM培养液，在37.5°C,5% CO2的培养箱中培养。在经历至少4-6天，甚至是18天之后，马的皮肤成纤维细胞才能被传代，进而建立起稳定的细胞株，培养时间长，效率较低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，利用胰蛋白酶和胶原蛋白酶I先后消化作用于驴皮的组织块，使相应的驴皮成纤维细胞被分离出来，进而高效快速地建立起驴皮成纤维细胞体外培养体系。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案:，包括以下步骤:A.取一块驴皮组织，放入75%酒精消毒漂洗后，用含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DPBS冲洗至少3次；B.将驴皮组织取出并用灭菌后的手术刀片将其表皮和皮下结缔组织剔除干净，再用灭菌后的手术剪刀将其剪成肉糜状组织块；C.将肉糜状组织块放入经灭菌的圆底玻璃瓶中，加入0.25%胰蛋白酶在37°C温度下孵育Ih后，再加入0.5%的胶原蛋白酶I在37°C温度下处理6h，可见肉糜状组织块大部分都已经消失，显微镜下可观察到悬浮离散的细胞以及一些毛发和少许游离组织块，再用0.45 μ m过滤器过滤后可得较为纯净的驴皮成纤维细胞的悬浮液；D.将悬浮液离心处理，弃去上清，加培养液重悬后转入培养皿中，再加Iml培养液，在37°C、5% CO2浓度的培养箱中培养30min后，将含有大部分上皮细胞的培养液弃去，重新加入培养液，在培养箱内进行培养；E.2-3天后，待细胞长满即可消化传代，至此，稳定的驴皮成纤维细胞体外培养体系建成。作为对本专利技术的一种优选，所述步骤D中的悬浮液的离心处理采用1000r/min，离心处理4min。作为对本专利技术的一种优选，所述步骤D中的培养液包括DMEM及10% FBS。作为对本专利技术的一种优选，所述步骤C中的圆底玻璃瓶采用上小下大的结构。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果是:克服了驴皮成纤维细胞因驴皮中含有大量胶原蛋白而不便被体外培养的难题，且仅需三天左右便可建立稳定的驴皮成纤维细胞体外培养体系，时间短，效率高。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。，包括以下步骤:A.用剃毛刀将驴身上一小片区域的毛发剔除干净，利用消毒后的取皮器取下约Icm3的驴皮组织，迅速放入事先加入含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DPBS中，带回实验室；用灭菌的镊子将驴皮组织取出，放入75%酒精中漂洗lmin，随后再放入含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DPBS中冲洗三次以上；B.将驴皮组织取出并用灭菌后的手术刀片将其表皮和皮下结缔组织剔除干净，再用灭菌后的手术剪刀将其剪成肉糜状组织块；C.将肉糜状组织块放入经灭菌的圆底玻璃瓶中，其中圆底玻璃瓶的选择原则为采用上小下大的结构，加入2ml,0.25%胰蛋白酶在37°C水浴锅或者培养箱中孵育Ih后，再加入21111、0.5%的胶原蛋白酶1在37°0温度下处理611，可见肉糜状组织块大部分都已经消失，显微镜下可观察到悬浮离散的细胞以及一些毛发和少许游离组织块，再用0.45 μ m过滤器过滤后可得较为纯净的驴皮成纤维细胞的悬浮液；D.将悬浮液利用1000r/min离心处理4min，弃去上清，加含DMEM及10% FBS的培养液重悬后转入培养皿中，再加Iml培养液，在37°C、5% CO2浓度的培养箱中培养30min后，将含有大部分上皮细胞的培养液弃去，重新加入培养液，在培养箱内进行培养；E.2-3天后，待细胞长满即可消化传代，至此，稳定的驴皮成纤维细胞体外培养体系建成。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例而已，并不用以限制本专利技术，凡在本专利技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。【主权项】1.，其特征在于，包括以下步骤: A.取一块驴皮组织，放入75%酒精消毒漂洗后，用含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DPBS冲洗至少3次； B.将驴皮组织取出并用灭菌后的手术刀片将其表皮和皮下结缔组织剔除干净，再用灭菌后的手术剪刀将其剪成肉糜状组织块； C.将肉糜状组织块放入经灭菌的圆底玻璃瓶中，加入0.25 %胰蛋白酶在370C温度下孵育Ih后，再加入0.5%的胶原蛋白酶I在37°C温度下处理6h，可见肉糜状组织块大部分都已经消失，显微镜下可观察到悬浮离散的细胞以及一些毛发和少许游离组织块，再用0.45 μ m过滤器过滤后可得较为纯净的驴皮成纤维细胞的悬浮液； D.将悬浮液离心处理，弃去上清，加培养液重悬后转入培养皿中，再加Iml培养液，在37°C、5% CO2浓度的培养箱中培养30min后，将含有大部分上皮细胞的培养液弃去，重新加入培养液，在培养箱内进行培养； E.2-3天后，待细胞长满即可消化传代，至此，稳定的驴皮成纤维细胞体外培养体系建成。2.根据权利要求1所述的驴皮成纤维细胞体外快速培养的方法，其特征在于，所述步骤D中的悬浮液的离心处理采用1000r/min，离心处理4min。3.根据权利要求1所述的驴皮成纤维细胞体外快速培养的方法，其特征在于，所述步骤D中的培养液包括DMEM及10 % FBSo4.根据权利要求1所述的驴皮成纤维细胞体外快速培养的方法，其特征在于，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种驴皮成纤维细胞体外快速培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.取一块驴皮组织，放入75％酒精消毒漂洗后，用含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DPBS冲洗至少3次；B.将驴皮组织取出并用灭菌后的手术刀片将其表皮和皮下结缔组织剔除干净，再用灭菌后的手术剪刀将其剪成肉糜状组织块；C.将肉糜状组织块放入经灭菌的圆底玻璃瓶中，加入0.25％胰蛋白酶在37℃温度下孵育1h后，再加入0.5％的胶原蛋白酶I在37℃温度下处理6h，可见肉糜状组织块大部分都已经消失，显微镜下可观察到悬浮离散的细胞以及一些毛发和少许游离组织块，再用0.45μm过滤器过滤后可得较为纯净的驴皮成纤维细胞的悬浮液；D.将悬浮液离心处理，弃去上清，加培养液重悬后转入培养皿中，再加1ml培养液，在37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养30min后，将含有大部分上皮细胞的培养液弃去，重新加入培养液，在培养箱内进行培养；E.2‑3天后，待细胞长满即可消化传代，至此，稳定的驴皮成纤维细胞体外培养体系建成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾维斌，王艳萍，高帅，王惠娥，马国海，王莉，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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