建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法技术

本发明专利技术涉及一种建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，属于动物细胞（组织）工程领域。胶原酶消化成年大鼠胰腺组织，Dextron不连续密度梯度离心，RPMI1640有血清培养，胰腺导管原代上皮样干细胞贴壁生长，克隆环筛选，上皮样干细胞纯化，胰蛋白酶消化液消化传代，建立细胞系；采用该方法建立的一例大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的特征是细胞贴壁呈多角形上皮样，克隆性生长，是正常的二倍体细胞，在蛋白水平表达增殖细胞核抗原、八聚体转录因子4、干细胞关键蛋白、角蛋白19和神经源性分化因子2，具有多分化潜能，无致瘤性。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
建立大鼠胰腺导管上皮样干细胞系的方法，其特征在于：包括如下步骤：                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 （1）大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞分离培养 无菌取大鼠胰腺组织，剪碎至1mm³，胶原酶消化，Dextron不连续密度梯度离心，收集Dextron分离液处细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，大鼠胰腺导管原代上皮样干细胞贴壁生长；（2）大鼠胰腺导管上皮样干细胞纯化  打开培养皿，将底部沾有凡士林的克隆环置于胰腺导管上皮样干细胞区域内，在克隆环孔中消化，收集克隆环中的细胞，接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，RPMI1640+10%NBS培养液培养，纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞克隆性生长；当细胞生长至80%融合时，呈“铺路石”样；（3）大鼠胰腺导管上皮样干细胞传代培养当纯化的大鼠胰腺导管上皮样干细胞生长至80%融合，加入胰蛋白酶消化液消化，收集的细胞接种在铺有0.1%明胶的培养皿中，细胞培养液扩增培养；1例大鼠胰腺导管上皮样干细胞已传80代；（4）大鼠胰腺导管上皮样干细胞冷冻保存冷冻：用细胞冷冻液稀释大鼠胰腺导管上皮样干细胞，分装于冷冻管，平衡，投入液氮长期冷冻保存；解冻：从液氮罐中取出大鼠胰腺导管上皮样干细胞冷冻管，迅速投入37℃水域中解冻，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培养液贴壁培养；台盼蓝染色检测，大鼠胰腺导管上皮样干细胞解冻成活率为92%。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：效梅，安立龙，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44