本发明专利技术提供了从脐带胶质分离、处理和冷冻保存间充质细胞和从脐带组织分离、处理和冷冻保存血管祖细胞的方法和试剂盒。还提供了通过本发明专利技术方法得到的分离的间充质细胞或血管祖细胞及其组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景专利
本专利技术总体涉及间充质细胞和内皮祖细胞，更具体地涉及从脐带组织分离间充质细胞和血管祖细胞的方法。背景信息已经确定的是，间充质基质(Mesenchymal Stromal)细胞或祖细胞或干细胞的优良来源是脐带胶质(Wharton’ s jelly),脐带胶质是脐带的基质。脐带源自胚胎发育第13天的胚外中胚层，由两条动脉和一条静脉组成，其均被脐带胶质包围，脐带胶质是唯一的富含蛋白多糖和粘多糖的结缔组织间质。这些嵌入富含胶原蛋白的基质的基质细胞是成肌纤 维细胞，而非典型的成纤维细胞。在近期的研究中，带间质细胞被报道随脐带基质细胞分化为间充质细胞系，如心肌形成(cardiomyogenic)型、软骨形成型、成骨型和脂肪形成型，而具有间充质干细胞特性。人血管周围脐细胞的分离、培养和分化行为和得到的成骨结节已被多个研究人员证明。人脐带间充质干细胞分化为多巴胺能神经元的能力也已被证明。最近，一些胚胎干细胞标记物，如Oct-4、Sox-2和Nanog,在猪脐带基质细胞中得到证明。类似地，得自脐带血管系统的内皮祖细胞已显示具有得自其他来源的类似祖细胞的性质。国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy)定义的间充质基质细胞(MSCs)是具有特定表面表型的塑性粘附细胞，并具有增殖(自我更新)和分化成包括骨、软骨、脂肪的多种谱系的能力。这种细胞可来自几种不同来源，如骨小梁、脂肪组织、滑膜、骨骼肌、真皮、周细胞、血液和骨髓。来自骨髓和脂肪组织的MSC已被广泛研究。来自骨髓的MSC可分化成骨、软骨、腱、肌肉、脂肪组织和造血细胞支持基质。因此，其是治疗患有骨疾病、心脏衰竭等的患者的选择。由于MSC可从成人大量分离，其已被严密地考察了治疗效用。例如，MSC支持造血干细胞的体外扩张，充当免疫调节剂，释放细胞因子和生长因子，并且其导向病理位点。大量试验正利用来自骨髓的MSC进行，用于多种适应症，例如，急性心肌梗塞、中风和移植物抗宿主病。但是，基于细胞的治疗存在关于来自骨髓的MSC的限制。例如，从骨髓采集MSC是侵入性和有疼痛的程序。在正常衰老过程中，骨髓腔填充着黄色脂肪。因此，从老年个体获得MSC可能存在困难。在这些前提下，已找到采集自胎儿的骨髓的MSC与来自成人的MSC之间的区别。例如，胎儿MSC与来自成人的MSC相比在体外具有较长的寿命，而来自成人的MSC在体外具有约5代(passage)的有用寿命。研究人员已证明来自脐带中的脐带胶质的细胞(所谓脐带基质细胞或UCMSC)具有MSC的性质。虽然UCMSC具有类似于来自骨髓和脂肪的MSC的表面表型、分化能力和免疫性质，但UCMSC在其体外扩张潜力方面更类似于胎儿MSC。与来自骨髓和脂肪的MSC相比，UCMSC在出生后被从脐带分离，并可在正常阴道分娩或剖腹产后被收集。UCMSC可容易在体外扩张，并可低温储存、解冻和复苏。UCMSC如塑性粘附细胞般生长，表达类似于其他MSC的表面表型，并分化成多种谱系。脐带基质细胞已被安全移植，并改善帕金森病(Parkinson’s disease)、心搏停止/复苏相关神经损伤、视网膜疾病和全脑缺血(cerebralglobal ischemia)的动物模型的症状。脐带MSC。MSC已被从脐带多个区室分离(图I)。具体地，MSC已被从脐带血、脐静脉内皮下层和脐带胶质分离(图I)。在脐带胶质中，MSC已被从如下三个相对不明确的区域分离血管周围区、血管间区和羊膜下层(subamnion)。从脐带不同区室分离的MSC是否代表不同的群体是未知的。本讨论限于从脐带胶质细胞(WJC :图I的第3 - 5区)分离的MSC。脐带胶质细胞(WJC)亚群显示MSC表面标记物，表明其属于MSC家族。WJC具有基质支持性，其源自胚胎发生早期阶段，如胚外间充质，即原始脐带胶质一在其从卵黄sac区域迁移至主动脉-性腺-中肾(AGM)的过程中包围迁移胚胎血岛细胞。WJC保持该性质，如其在体外造血扩张和体内植入HSC中的作用所证明。已报道WJC产生的细胞因子类似于BMSC的细胞因子，并且WJC合成BMSC不合成的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。WJC不同于BMSC，因为WJC较慢分化成脂肪细胞。由于这个特征和其他特征(下文列举)是来自脐带血(UCB)的MSC共有的，不清楚是否来自UCB的MSC不同于脐带胶质中发现的细胞。UCB-MSC和WJC具有多个共性，如 分化成脂肪细胞的能力不良、倍增时间比BMSC短以及衰老传代数较大。如同WJC，UCB-MSC可形成GM-CSF，尽管这还未被一致地发现。明确的是，HSC可通过来自UCB和WJC的MSC扩张(图I)。脐带中的区室。5个单独的区域已显示包含间充质基质细胞=(I)MSC可从20-50%由脐带血新制的单核细胞部分分离；(2)MSC已被从脐静脉内皮下层分离；(3)MSC可在酶解脐血管外层——例如血管周围区域——后分离；(4)健康个体的血管内空间不断生成MSC; (5)羊膜下层区域。脐带胶质包括第3至5区。此评论侧重于来自脐带胶质的细胞，而非来自脐带血(第I区)或脐静脉内皮下层(第2区)的MSC。BMSC、UCB-MSC和WJC之间存在差异。第一，来自骨髓的集落形成单位的分离频率(CFU)-F，经评估在每106个单核细胞(MNCs)I - 10CFU-F的范围内，且在脐带血中被报道为每108个MNCs约ICFU-F克隆至每106个MNCs约I - 3CFU-F。[注意来自第一期胎血的MSC的分离频率为每106个MNCs 8. 2CFU-F]。相反，来自脐带胶质的细胞具有较高的CFU-F频率。因此，可在WJ的最初分离中发现，来自脐带胶质的基质细胞的MSC数量级大于骨髓或脐带血。第二，与较大的CFU-F频率相伴，WJC和UCB-MSC的倍增时间比来自成人骨髓的MSC (BMSC)短。较快的倍增时间是来自胎血、脐带血和脐带胶质的MSC的共同特征，并且该共同特征被认为反应出这些MSC与成人BMSC相比相对原始的性质。UCB-MSC与WJC之间的重要差异是WJC可从接近100%的样本，甚至从其处理延迟长达48小时的脐带分离。脐带胶质细胞，如同骨髓间质细胞和其他间充质细胞，具有塑性粘附性，对于间充质细胞标记物如⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶90和⑶105的染色呈阳性，以及对于造血谱系标记物呈阴性。此外，WJC在形态上类似于MSC，并可在培养中比来自骨髓的MSC更加扩张。人WJC表达前体细胞标记物如巢蛋白。WJC可经诱导形成脂肪组织、骨、软骨、骨骼肌细胞、心肌细胞型细胞和神经细胞，并适于生物医学工程应用。因此，这些细胞归为原始基质细胞类别；并且，由于脐带胶质是细胞的大量且低廉的来源，其似乎潜在地影响如下领域如再生医学、生物技术和农业。需要进一步的工作以确定WJC是否长期植入和在体内呈现自我更新和多潜能性，由此，证明WJC是真正的干细胞群。专利技术概述本专利技术涉及从脐带胶质分离、处理和冷冻保存包括亚群间充质干细胞的单核细胞和从脐带组织分离、处理和冷冻保存包括内皮祖细胞亚群的血管细胞的方法和专用试剂盒。在本专利技术的一个实施方式中，提本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.18 US 61/288,2111.从脐带组织分离间充质细胞的方法，包括 a)从脐带样本的脐带胶质(WJ)基质分离血管组织； b)从所述WJ基质解离细胞，并悬浮于血浆中； c)从未解离的细胞和基质分离解离的细胞；和 d)冷冻保存所述分离的解离细胞，从而从脐组织分离间充质细胞。2.权利要求I所述的方法，其中冷冻保存包括将冷冻保护剂与所述分离的解离细胞混入口 o3.权利要求I所述的方法，进一步包括验证所述分离的解离细胞不含细菌污染物。4.通过权利要求I所述方法得到的分离的间充质细胞。5.从脐...
【专利技术属性】
技术研发人员：Z·卡利斯，K·马特西斯，
申请(专利权)人：CBB生命线生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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