【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
技术实现思路
【技术保护点】
1.一种具有新霉素磷酸转移酶活性的非天然存在的新霉素磷酸转移酶(NPT)，其中所述非天然存在的NPT包含具有以下项的野生型新霉素磷酸转移酶的氨基酸序列：
2.一种具有新霉素磷酸转移酶活性的非天然存在的新霉素磷酸转移酶(NPT)，其中所述非天然存在的NPT包含具有以下项的SEQ ID NO:1的氨基酸序列：
3.根据权利要求1所述的NPT，其中相比于野生型NPT，所述非天然存在的NPT作为选择性标记具有衰减的新霉素磷酸转移酶活性。
4.根据权利要求1或3所述的NPT，其中所述野生型NPT包含与SEQID NO:1至少80％、至少90％...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种具有新霉素磷酸转移酶活性的非天然存在的新霉素磷酸转移酶(npt)，其中所述非天然存在的npt包含具有以下项的野生型新霉素磷酸转移酶的氨基酸序列：
2.一种具有新霉素磷酸转移酶活性的非天然存在的新霉素磷酸转移酶(npt)，其中所述非天然存在的npt包含具有以下项的seq id no:1的氨基酸序列：
3.根据权利要求1所述的npt，其中相比于野生型npt，所述非天然存在的npt作为选择性标记具有衰减的新霉素磷酸转移酶活性。
4.根据权利要求1或3所述的npt，其中所述野生型npt包含与seqid no:1至少80％、至少90％或至少98％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求1或3所述的npt，其中所述野生型npt包含与seqid no:1至少60％、至少65％、至少70％或至少75％相同的氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的npt，其中相比于包含seq id no:1的所述氨基酸序列的野生型npt，所述非天然存在的npt作为选择性标记具有衰减的新霉素磷酸转移酶活性。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的npt，其中相对于用编码野生型npt的核苷酸序列转染或转化的细菌细胞，在含有25μg/ml、75μg/ml或100μg/ml卡那霉素的板上生长48小时后，用编码所述非天然存在的npt的核苷酸序列转染或转化的细菌细胞表现出减少的集落形成，如通过集落形成测定所评估的；并且其中任选地，所述细菌细胞为大肠杆菌(e.coli)。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的npt，其中相对于用相同但包含编码野生型npt的核苷酸序列的表达载体转染的哺乳动物细胞，在含有500μg/ml遗传霉素(g418)的培养基中在组织培养板上生长2周后，用包含编码所述非天然存在的npt的核苷酸序列的表达载体转染的哺乳动物细胞表现出减少的集落形成，如通过集落形成测定所评估的；并且其中任选地，所述哺乳动物细胞为hek293细胞、cho细胞、per.c6细胞、鼠ns0细胞、纤维肉瘤ht-1080细胞、鼠sp2/0细胞、bhk细胞或鼠c127细胞。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的npt，其中相对于用相同但包含编码野生型npt的核苷酸序列的表达载体转染的哺乳动物细胞的g418抗性集落，用包含编码所述非天然存在的npt的核苷酸序列的表达载体转染的哺乳动物细胞的g418抗性集落以范围为0.001％至75％的频率产生。
10.根据权利要求2所述的npt，其中所述非天然存在的npt包含seqid no:38(v36m，g210a)、seq id no:39(v36m，e182d)、seq id no:40(v36m，y218f)、seq id no:41(d216g，d261n)、seq id no:42(v36m，y218s)或seq id no:43(v36m，d216g)的氨基酸序列。
11.一种核酸序列，所述核酸序列包含编码根据权利要求1至10中任一项所述的非天然存在的npt的第一核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的核酸序列，其中所述核酸序列还包含编码第二蛋白质或非编码rna的第二核苷酸序列；并且其中任选地，所述第二蛋白质为治疗性蛋白。
13.根据权利要求11或12所述的核酸序列，其中所述第一核苷酸序列包含seq id no:20、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:36或seq id no:37的核苷酸序列。
14.一种载体，所述载体包含根据权利要求11至13中任一项所述的核酸序列。
15.一种体外或离体宿主细胞，所述体外或离体宿主细胞包含根据权利要求1至10中任一项所述的非天然存在的npt。
16.一种体外或离体宿主细胞，所述体外或离体宿主细胞包含根据权利要求11至13中任一项所述的核酸序列或根据权利要求14所述的载体。
17.根据权利要求16所述的细胞，其中所述核酸序列被稳定整合至所述宿主细胞的基因组中。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的细胞，其中所述宿主细胞还包含编码第二蛋白质或非编码rna的第二核酸序列，并且其中所述第二蛋白质任选地为治疗性蛋白；或者其中任选地，所述第二核酸序列编码非编码rna；并且其中任选地，所述非编码rna为shrna、mirna、反义rna、用于crispr核酸酶的引导rna、催化rna、核糖体rna或trna。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的细胞，其中所述宿主细胞为细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞；任选地其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
20.一种用于从其中引入了转基因的宿主细胞群中选择具有高拷贝数的转基因和/或高表达水平的转基因的细胞的方法，所述方法包括：
21.根据权利要求20所述的方法，其中：
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述宿主细胞为细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞；任选地其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
23.根据权利要求20、21或22所述的方法，其中所述核酸序列被稳定整合至所选择的细胞的基因组中。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所选择的细胞具有高拷贝数的所述转基因。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所选择的细胞具有高表达水平的所述转基因。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所选择的细胞已经将所述转基因的5个至100个拷贝整合至它们的基因组dna中。
27.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所选择的细胞已经将所述转基因的1个至5个拷贝整合至它们的基因组dna中。
28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述转基因包含病毒基因或生长因子基因，或者所述转基因编码蛋白质或非编码rna；其中任选地，所述非编码rna选自由以下项组成的组：反义...
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