【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】 本申请要求提交于2012年5月4日的美国临时申请61/642470和提交于2012年 8月16日的美国临时申请61/683765的权益；两者的全文以引用方式并入本文。
本专利技术涉及分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及具有大范围核酸酶活性的序 列。
技术介绍
通过重组DNA技术，很容易将外源DNA序列插入生物体的基因组，从而改变所述生 物体的表型。最常用的植物转化方法是农杆菌感染法和基因枪粒子轰击法，其中转基因以 随机模式和不可预知的拷贝数整合至植物基因组中。因此，研究人员正在努力控制植物中 的转基因整合。 已经使用了位点特异性整合技术（采用了位置特异性整合系统以及其它类型的 整合系统）以在多个生物体中生成目的基因的靶向插入。 其它插入和修饰DNA序列的方法涉及通过导入两翼为与基因组靶标同源的序列 的转基因 DNA序列的同源DNA重组。美国专利5, 527, 695描述了用DNA序列（靶向真核生 物DNA的预先确定的序列）转化真核细胞。通过使用选择性标记（作为被导入的DNA序列 中的一部分）鉴定经转化的细胞。 虽然两种系统已经提供了对于目的序列的靶向插入可用的技术，但仍然存在对便 于精确改造植物或酵母基因组的核酸酶的需求。此外，存在对于具有增大的、能在很宽的温 度范围内引入双链断裂的大范围核酸酶的需求。
技术实现思路
提供了包含具有大范围核酸酶活性的多核苷酸和多肽的组合物和方法。还提供了 包含编码变体大范围核酸酶的多核苷酸的组合物，所述变体大范围核酸酶包含至少一个氨 基酸修饰，其中所述变体大范围核酸酶...
【技术保护点】
一种分离的或重组的多核苷酸，其包含编码大范围核酸酶多肽的核苷酸序列，所述多肽包含：a)在对应于SEQ ID NO：1的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO：1的位置选自位置2、12、16、22、23、31、36、43、50、56、58、59、62、71、72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、128、129、131、147、151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、194、195、196、197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、282、289、308、311、312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.04 US 61/642，470;2012.08.16 US 61/683，7651. 一种分离的或重组的多核苷酸，其包含编码大范围核酸酶多肽的核苷酸序列，所述 多肽包含： a) 在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸 序列，所述 SEQ ID NO :1 的位置选自位置 2、12、16、22、23、31、36、43、50、56、58、59、62、71、 72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、128、129、131、147、 151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、 176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、194、195、196、 197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、282、289、308、311、 312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；或 b) 具有（a)的任何氨基酸修饰中的至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43或44个的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO :1具有至少80%的序列同一性的大范围核酸酶多肽。3. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰包 括： a) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置2的位置处的天冬氨酸（D); b) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸⑶； c) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸（I); d) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸（C); e) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置23的位置处的亮氨酸（L); f) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸（R); g) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺（N); h) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸（L); i) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置50的位置处的精氨酸（R)或赖氨酸（K); j) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置56的位置处的亮氨酸（L); k) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸（I); l) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸⑶或丙氨酸（A); m) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸（V); n) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置71的位置处的赖氨酸（K); 〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置72的位置处的苏氨酸（T); P)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置73的位置处的丙氨酸（A); q) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置80的位置处的精氨酸（R); r) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置81的位置处的赖氨酸（K); s) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置82的位置处的精氨酸（R); t) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置86的位置处的天冬氨酸（D); u) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置91的位置处的异亮氨酸（I); v) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置95的位置处的异亮氨酸（I); w) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置98的位置处的精氨酸（R); X)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置103的位置处的缬氨酸（V); y) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置113的位置处的丝氨酸（S); z) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置114的位置处的脯氨酸（P); aa)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置116的位置处的精氨酸（R); bb) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置117的位置处的甘氨酸（G); cc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置118的位置处的苏氨酸⑴； dd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置121的位置处的甘氨酸（G); ee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置124的位置处的精氨酸（R); ff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置128的位置处的半胱氨酸（C): gg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置129的位置处的丙氨酸（A); hh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置131的位置处的精氨酸（R); ii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置147的位置处的丝氨酸⑶； jj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置151的位置处的丙氨酸（A); kk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置153的位置处的亮氨酸（L)或甲硫氨酸（M); 11)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置159的位置处的色氨酸（W); mm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置160的位置处的谷氨酸（E); nn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置161的位置处的缬氨酸（V); 〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置162的位置处的酪氨酸（Y); PP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置163的位置处的精氨酸（R); qq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置164的位置处的组氨酸（H); rr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置165的位置处的亮氨酸（L); ss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置166的位置处的精氨酸（R); tt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置167的位置处的组氨酸（H); uu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置168的位置处的脯氨酸（P); w) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置169的位置处的丙氨酸（A); ww)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置170的位置处的脯氨酸（P); xx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置171的位置处的组氨酸（H); yy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置172的位置处的脯氨酸（P); zz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置173的位置处的精氨酸（R); aaa) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置174的位置处的亮氨酸（L); bbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置175的位置处的脯氨酸⑵； ccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置176的位置处的谷氨酰胺（Q); ddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置177的位置处的丙氨酸（A); eee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置178的位置处的精氨酸（R); fff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置179的位置处的缬氨酸（V); ggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置180的位置处的谷氨酰胺（Q); hhh)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置182的位置处的缬氨酸（V); iii) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置183的位置处的脯氨酸（P); jjj)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置184的位置处的赖氨酸（K); ккк) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置185的位置处的苏氨酸⑴或组氨酸⑶； 111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置186的位置处的丝氨酸（S); mmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置187的位置处的谷氨酸（E); nnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置188的位置处的亮氨酸（L); 〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置189的位置处的谷氨酸（E); PPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置190的位置处的谷氨酰胺（Q); qqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置191的位置处的亮氨酸（L); rrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置194的位置处的脯氨酸（P); sss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置195的位置处的赖氨酸（K); ttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置196的位置处的丝氨酸（S); uuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置197的位置处的苯丙氨酸（F); vvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置200的位置处的异亮氨酸（I); www)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置203的位置处的缬氨酸（V); xxx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置204的位置处的亮氨酸（L); yyy)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置209的位置处的半胱氨酸（C); zzz)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置222的位置处的亮氨酸（L); аааа) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置232的位置处的异亮氨酸（I); bbbb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置236的位置处的丝氨酸（S); cccc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置237的位置处的亮氨酸（L)或精氨酸（R); dddd)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置246的位置处的组氨酸（H); eeee)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置254的位置处的异亮氨酸（I); ffff)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置258的位置处的丝氨酸（S); gggg)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置267的位置处的精氨酸（R); hhhh)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置278的位置处的异亮氨酸（I); iiii)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置281的位置处的酪氨酸（Y); jjjj)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置282的位置处的苯丙氨酸（F); kkkk)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置289的位置处的苏氨酸（T); 1111)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置308的位置处的甘氨酸（G); _m)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置311的位置处的精氨酸（R); nnnn)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置312的位置处的丙氨酸（A); 〇〇〇〇)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置316的位置处的丙氨酸（A); PPPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置318的位置处的精氨酸（R); qqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置334的位置处的丙氨酸（A); rrrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置339的位置处的苯丙氨酸（F); ssss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置340的位置处的甘氨酸（G)或亮氨酸（L); tttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置342的位置处的丝氨酸（S); uuuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置345的位置处的天冬酰胺（N); vwv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置346的位置处的天冬酰胺（N); 醫醫）在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置348的位置处的天冬酰胺（N);或 xxxx)a)至wwww)的任何组合。4.根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范围 核酸酶多肽，其中所述多肽还包含： a) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置2的位置处的天冬氨酸（D); b) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸⑶； c) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸（I); d) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置19的位置处的丝氨酸⑶或丙氨酸（A); e) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸（C); f) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置23的位置处的亮氨酸（L); g) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置24的位置处的甲硫氨酸（M); h) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置28的位置处的精氨酸（R)或丙氨酸（A); i) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置30的位置处的精氨酸（R)、丙氨酸（A)、谷氨 酰胺（Q)、半胱氨酸（C)、甘氨酸（G)、丝氨酸（S)、苏氨酸（T)、亮氨酸（L)、谷氨酸（E)或脯 氨酸（P); j) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸（R); k) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置32的位置处的精氨酸（R)、丙氨酸（A)、赖氨 酸⑷、谷氨酰胺（Q)、甘氨酸（G)或亮氨酸（L); l) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺（N); m) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸（L); n) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置50的位置处的精氨酸（R)或赖氨酸（K); 〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置54的位置处的异亮氨酸⑴或亮氨酸（L); P)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置56的位置处的亮氨酸（L); q) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置57的位置处的谷氨酸（E); r) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸（I); s) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸⑶或丙氨酸（A); t) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸（V); u) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置71的位置处的赖氨酸（K); v) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置72的位置处的苏氨酸（T); w) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置73的位置处的丙氨酸（A); x) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置79的位置处的甘氨酸（G); y) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置80的位置处的精氨酸（R); z) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置81的位置处的赖氨酸（K); aa)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置82的位置处的精氨酸（R); bb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置86的位置处的天冬氨酸（D); cc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置87的位置处的亮氨酸（L); dd)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置91的位置处的异亮氨酸（I); ee)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置95的位置处的异亮氨酸（I); ff)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置98的位置处的精氨酸（R); gg)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置103的位置处的缬氨酸（V); hh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置105的位置处的丙氨酸（A); ii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置111的位置处的精氨酸（R); jj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置113的位置处的丝氨酸⑶； kk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置114的位置处的脯氨酸（P); II) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置116的位置处的精氨酸（R); mm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置117的位置处的甘氨酸（G); nn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置118的位置处的苏氨酸⑴； 〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置121的位置处的甘氨酸（G); PP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置124的位置处的精氨酸（R); qq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置128的位置处的半胱氨酸（C); rr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置129的位置处的丙氨酸（A); ss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置131的位置处的精氨酸（R); tt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置132的位置处的缬氨酸（V); uu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置147的位置处的丝氨酸（S); vv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置151的位置处的丙氨酸（A); ww)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置153的位置处的亮氨酸（L)或甲硫氨酸（M); xx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置159的位置处的色氨酸（W); yy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置160的位置处的谷氨酸（E); zz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置161的位置处的缬氨酸（V); aaa) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置162的位置处的酪氨酸（Y); bbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置163的位置处的精氨酸（R); ccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置164的位置处的组氨酸（H); ddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置165的位置处的亮氨酸（L); eee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置166的位置处的精氨酸（R); fff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置167的位置处的组氨酸（H); ggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置168的位置处的脯氨酸（P); hhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置169的位置处的丙氨酸（A); iii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置170的位置处的脯氨酸（P); jjj)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置171的位置处的组氨酸（H); kkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置172的位置处的脯氨酸⑵； III) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置173的位置处的精氨酸（R); mmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置174的位置处的亮氨酸（L); nnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置175的位置处的脯氨酸⑵； 〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置176的位置处的谷氨酰胺（Q); PPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置177的位置处的丙氨酸（A); qqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置178的位置处的精氨酸（R); rrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置179的位置处的缬氨酸（V); sss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置180的位置处的谷氨酰胺（Q); ttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置182的位置处的缬氨酸（V); uuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置183的位置处的脯氨酸（P); vvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置184的位置处的赖氨酸（K); www)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置185的位置处的苏氨酸⑴或组氨酸⑶： xxx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置186的位置处的丝氨酸（S); yyy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置187的位置处的谷氨酸（E); zzz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置188的位置处的亮氨酸（L); aaaa)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置189的位置处的谷氨酸（E); bbbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置190的位置处的谷氨酰胺（Q); cccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置191的位置处的亮氨酸（L); dddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置192的位置处的氨基酸缺失； eeee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置194的位置处的脯氨酸（P); ffff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置195的位置处的赖氨酸（K); gggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置196的位置处的丝氨酸（S); hhhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置197的位置处的苯丙氨酸（F); iiii)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置200的位置处的异亮氨酸（I); jjjj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置203的位置处的缬氨酸（V); kkkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置204的位置处的亮氨酸（L); 1111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置206的位置处的丙氨酸（A)或丝氨酸（S); _m)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置209的位置处的半胱氨酸（C); nnnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置222的位置处的亮氨酸（L); 〇〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置211的位置处的甲硫氨酸（M); PPPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置232的位置处的异亮氨酸（I); qqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置236的位置处的丝氨酸（S); rrrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置237的位置处的亮氨酸（L)或精氨酸（R); ssss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置241的位置处的异亮氨酸（I)或亮氨酸 (L)； tttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置244的位置处的谷氨酸（E); uuuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置246的位置处的组氨酸（H); vvvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置253的位置处的天冬氨酸（D)或组氨酸 (H)； 醫醫）在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置254的位置处的异亮氨酸（I); xxxx)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置258的位置处的丝氨酸（S); yyyy)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置267的位置处的精氨酸（R); zzzz)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置278的位置处的异亮氨酸（I); aaaaa) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置281的位置处的酪氨酸（Y); bbbbb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置282的位置处的苯丙氨酸（F); ccccc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置289的位置处的苏氨酸（T); ddddd)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置292的位置处的丙氨酸（A); eeeee)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置308的位置处的甘氨酸（G); fffff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置311的位置处的精氨酸（R); ggggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置312的位置处的丙氨酸（A); hhhhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置316的位置处的丙氨酸（A); iiiii)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置318的位置处的精氨酸（R); jjjjj)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置319的位置处的缬氨酸（V); kkkkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置334的位置处的丙氨酸（A); 11111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置339的位置处的苯丙氨酸（F); mmmmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置340的位置处的甘氨酸（G)或亮氨酸（L); nnnnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置342的位置处的丝氨酸（S); 〇〇〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置345的位置处的天冬酰胺（N); ppppp)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置346的位置处的天冬酰胺（N);或 qqqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置348的位置处的天冬酰胺（N);或 rrrrr)a)至qqqqq)的任何组合。5. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范围 核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、 136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、 155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、251、252、253、272、273、274、 275、272、273、274、275、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、 298、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、357、358、359、360、361、362、 363、364、365、366、367、368、369、370、371、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、 400、401、402、403、430、431、432 和 433。6. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范围 核酸酶多肽，其中所述多肽能够识别和裂解大范围核酸酶识别序列，所述大范围核酸酶识 别序列选自 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:85、SEQ ID N0:269、SEQ ID N0:281、SEQ ID N0:331、 SEQ ID NO :358、SEQ ID NO :390、SEQ ID NO :423 或 SEQ ID NO :424。7. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范围 核酸酶多肽，其中所述多肽在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时具有 提1?的大范围核酸酶活性。8. 根据权利要求7所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述对照大范围核酸酶选自 SEQ ID N0：USEQ ID NO ： 86, SEQ ID NO ： 250, SEQ ID NO ： 270, SEQ ID NO ： 27 U SEQ ID NO： 282、SEQIDN0:283、SEQIDN0:329、SEQIDN0:356、SEQIDN0 :389、SEQIDN0:429 * SEQ ID NO :435。9. 根据权利要求7所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述提高的大范围核酸酶活 性的证据是： a)在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的酵母测定得分； 或 b) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的目标位点突变率； 或 c) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的体外切割；或 d) (a)、（b)和（c)的任何组合。10. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其还包含编码N-末端核转运肽 的核苷酸序列。11. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其还包含编码C-末端组氨酸标 签的核苷酸序列。12. 根据权利要求7所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述提高的大范围核酸酶 活性是在16°C、24°C、28°C、30°C或37°C下测定的。13. -种重组DNA构建体，其包含权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸。14. 根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其还包含可操作地连接至所述多核苷酸 的启动子。15. 根据权利要求14所述的重组DNA构建体，其中所述启动子相对于所述多核苷酸是 异源的，或所述启动子相对于所述多核苷酸是同源的。16. -种细胞，其包含至少一种权利要求1所述的多核苷酸或权利要求13所述的重组 DNA构建体，其中所述多核苷酸对于所述细胞是异源的。17. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。18. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。19. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述多核苷酸或所述重组DNA构建体稳定地掺 入至所述植物细胞的基因组中。20. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述多核苷酸或所述重组DNA构建体稳定地掺 入至所述植物细胞的叶绿体基因组中。21. 根据权利要求18所述的细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。22. 根据权利要求21所述的细胞，其中所述单子叶植物为玉米、小麦、稻、大麦、甘蔗、 高粱或黑麦。23. 根据权利要求18所述的细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。24. 根据权利要求23所述的细胞，其中所述双子叶植物为大豆、芸苔属植物 (Brassica)、向日葵、棉花或苜猜。25. -种植物，其包含权利要求18所述的植物细胞。26. -种植物外植体，其包含权利要求18所述的植物细胞。27. 根据权利要求26所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述植物、外植体或植物细 胞在与不包含至少一种权利要求1所述的多核苷酸的相同物种、品系或品种的植物、外植 体或植物细胞进行比较时表现出提高的大范围核酸酶活性。28. -种转基因种子，其由权利要求25所述的植物产生。29. -种具有大范围核酸酶活性的分离的多肽，所述多肽包含： a)在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸 序列，所述 SEQ ID NO :1 的位置选自位置 2、12、16、22、23、31、36、43、50、56、58、59、62、71、 72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、128、129、131、147、 151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、 176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、194、195、196、 197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、282、289、308、311、 312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；或 b)具有（a)的任何氨基酸修饰中的至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43或44个的氨基酸序列。30. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO :1具有至少80% 的序列同一'I生。31. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰包括： a) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置2的位置处的天冬氨酸（D); b) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸⑶； c) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸（I); d) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸（C); e) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置23的位置处的亮氨酸（L); f) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸（R); g) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺（N); h) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸（L); i) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置50的位置处的精氨酸（R)或赖氨酸（K); j) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置56的位置处的亮氨酸（L); k) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸（I); l) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸⑶或丙氨酸（A); m) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸（V); n) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置71的位置处的赖氨酸（K); 〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置72的位置处的苏氨酸（T); P)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置73的位置处的丙氨酸（A); q) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置80的位置处的精氨酸（R); r) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置81的位置处的赖氨酸（K); s) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置82的位置处的精氨酸（R); t) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置86的位置处的天冬氨酸（D); u) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置91的位置处的异亮氨酸（I); v) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置95的位置处的异亮氨酸（I); w) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置98的位置处的精氨酸（R); x) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置103的位置处的缬氨酸（V); y) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置113的位置处的丝氨酸（S); z) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置114的位置处的脯氨酸（P); aa)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置116的位置处的精氨酸（R); bb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置117的位置处的甘氨酸（G); cc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置118的位置处的苏氨酸⑴； dd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置121的位置处的甘氨酸（G); ee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置124的位置处的精氨酸（R); ff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置128的位置处的半胱氨酸（C); gg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置129的位置处的丙氨酸（A); hh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置131的位置处的精氨酸（R); ii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置147的位置处的丝氨酸⑶； jj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置151的位置处的丙氨酸（A); kk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置153的位置处的亮氨酸（L)或甲硫氨酸（M); II) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置159的位置处的色氨酸（W); mm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置160的位置处的谷氨酸（E); nn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置161的位置处的缬氨酸（V); 〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置162的位置处的酪氨酸（Y); PP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置163的位置处的精氨酸（R); qq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置164的位置处的组氨酸（H); rr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置165的位置处的亮氨酸（L); ss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置166的位置处的精氨酸（R); tt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置167的位置处的组氨酸（H); uu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置168的位置处的脯氨酸（P); vv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置169的位置处的丙氨酸（A); ww)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置170的位置处的脯氨酸（P); xx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置171的位置处的组氨酸（H); yy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置172的位置处的脯氨酸（P); zz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置173的位置处的精氨酸（R); aaa) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置174的位置处的亮氨酸（L); bbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置175的位置处的脯氨酸⑵； ccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置176的位置处的谷氨酰胺（Q); ddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置177的位置处的丙氨酸（A); eee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置178的位置处的精氨酸（R); fff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置179的位置处的缬氨酸（V); ggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置180的位置处的谷氨酰胺（Q); hhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置182的位置处的缬氨酸（V)...
【专利技术属性】
技术研发人员：E伯穆德兹，AM西甘，J恩格里斯，SC发科，H高，L刘，ZB刘，A安格，S斯维塔舍夫，JK杨，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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