用于DNA末端修复、腺苷酸化、磷酸化的酶组合物制造技术

提供随时可用的主混合物的酶组合物及其使用方法。所述组合物包含缺乏5'‑3'和3'‑5'外切核酸酶活性的经修饰的嗜热DNA聚合酶，其与T4DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核苷酸激酶和所有其它必要的组分包括反应缓冲液和三磷酸核苷预混，其为在一个管内并经两个步骤进行DNA钝化、磷酸化和单核苷酸延伸反应所需。除了其它益处外，不同的酶、缓冲液和三磷酸核苷的混合物在长期保存期间是稳定的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2013年9月25日提交的美国专利申请序列号61/882,480和2013年11月15日提交的美国专利申请序列号61/904,543的优先权，每个专利申请通过引用整体并入本文。用于高通量DNA测序的几种方法(Nature.437,376-380(2005)；Science.309(2005)728-1732)依赖通用的扩增反应，借此使DNA样本随机成片段，然后被处理，使得不同片段的末端均含有相同的DNA序列。可将具有通用末端的片段用单一对扩增引物在单一反应中进行扩增。在扩增前将片段文库分离成单分子水平确保被扩增的分子形成离散的群体。然后可进一步分析这些离散的群体。或者可在乳剂中(Nature.437,376-380(2005)；Science.309,5741,1728-1732(2005))或在表面上(NucleicAcidsResearch27,e34(1999)；NucleicAcidsResearch28,e87(2000))进行该分离。将通用启动序列添加到可待由聚合酶链式反应(PCR)扩增的靶的末端，可通过本领域那些技术人员所已知的多种方法来实现。例如，在其5'端含有通用序列，并在其3'端含有简并序列的通用引物可用于PCR(DOP-PCR,例如,PNAS93(1996)14676-14679)以扩增随机来自复杂靶序列或靶序列的复杂混合物的片段。该引物的简并3'部分在随机DNA位置退火，且可被延伸以生成在其5'端具有该通用序列的靶的拷贝。或者，可将含有通用启动序列的接头连接到所述靶序列的末端。该接头可以是单链的或双链的。双链接头可能具有突出端或可能具有平端。具有突出端的接头与靶序列上的突出端互补，该靶序列可能已经由限制性内切核酸酶消化而生成，或由DNA聚合酶或末端转移酶添加。具有平端的接头用在也是平端的靶，在将所述DNA剪切成片段的过程中形成，或由如本领域技术人员所已知的末端修复反应所形成。单一接头或两个不同接头可能与靶序列用于连接反应中。如果靶已被操作使得它的末端是一样的，即，两末端均是平的或两端均具有相同的突出，则单一相容的接头的连接将生成两端均具有那个接头的模板。然而，如果使用两个相容的接头，接头A和接头B，则形成连接产物的三种排列：在两端具有接头A的模板、在两端具有接头B的模板以及一端具有接头A且另一端具有接头B的模板。此最后的产物是，在一些情况下，来自连接反应唯一所需的产物，并且因此连接反应后的另外的纯化步骤是必要的，以从两端具有相同接头的连接产物中将其纯化。许多分子生物学研究技术和应用，如为下一代测序(NGS)制备DNA文库需要将合成的DNA接头添加到受关注的DNA片段的两端。通常通过以下步骤添加合成的接头：(1)通过物理方式或酶促剪切受关注的DNA样本，(2)将所得的DNA片段进行钝化和磷酸化；(3)将钝化的DNA片段的3'端由一个核苷酸延伸，优选由dATP延伸，(4)将所得的DNA片段连接到3'端具有dTTP延伸的接头。靶DNA片段的dA加尾防止它们与其它DNA片段的分子内或分子间的连接，且从而增加具有预期结构的片段的产率。最近意识到DNA片段的末端修复/钝化和dA加尾反应可在一个管内完成，首先通过在较低的温度下进行DNA钝化和磷酸化反应，然后在较高的温度下对该钝化的DNA片段进行加尾。可获得以类似的方式工作的商业NGS样本制备试剂盒(NxSeqDNASamplePrepKit,Lucigen；NEBNextUltraDNALibraryPrepKit,IlluminafromNEB；PureGenomeHENGSLibraryPrepReagents,EMDMilipore)。然而，只有EMDMillipore公开了用于DNA3'端末端延伸的酶：嗜热NovaTaqDNA聚合酶。其它两个供应商提供产品使用推荐(在65-72℃下孵育)，其引起本领域的技术人员认为嗜热DNA聚合酶还用于dA加尾步骤。表1显示来自NewEnglandBiolabs、EMDMilipore和Lucigen的DNA末端修复和dA加尾反应的商业试剂和方案。表1.来自商业供应商试剂盒所使用的单管DNA末端修复和dA加尾条件和试剂。NEB和Lucigen产品代表成套试剂，其中DNA末端修复(钝化和磷酸化)和dA加尾反应所需要的全部酶由用户合并成单一混合物中(酶混合物)。然而，所述反应缓冲液是单独提供的，且没有与酶预混成随时可用的主混合物。EMDMilipore试剂盒包含在单独小瓶内所提供的DNA末端修复和dA加尾反应的全部组分。其它供应商正提出双组分的工作流程，其中受关注的DNA片段首先被钝化和磷酸化，以及然后在第一步骤的酶失活或去除后，添加dA加尾酶。一般将两种充分表征的聚合酶推荐为在许多克隆方案中所使用的用于dA加尾反应的优选的酶：3'-5'外切核酸酶活性缺陷的嗜温Klenow片段突变体，或嗜热TaqDNA聚合酶。这些酶执行非模板指导合成的能力，如在DNA片段的DNA3'端添加额外的核苷酸，为本领域的技术人员所已知。然而，已知两个酶均表现某些偏好，其中最重要的是它们偏爱在其3'端有嘧啶(dT或dC)的DNA片段的3'末端延伸和具有3'-末端嘌呤(dA或dG)的那些DNA片段的仅局部延伸。结果是，效率低的dA加尾反应后剩余的钝DNA片段可参与分子内连接反应，从而形成在天然状态下基因组中不存在的杂合DNA分子。如果这样的杂合分子在其3'端含有dA延伸，接头序列可能被添加到它们，且然后这样的分子可进行测序反应。如果文库制剂含有许多这样的嵌合分子，则它们随后可能使基因组序列的装配复杂或损害基因组序列的装配。在NGS应用中嵌合DNA分子可能损害测序的基因组的装配。因此，需要用于NGS文库制备应用的非偏性DNA片段末端修复/加尾的改进的酶组合物。该公开的酶组合物在长期保存期间是稳定的，且当与在dA加尾步骤中常规使用的嗜热TaqDNA聚合酶和嗜温Klenow片段exo-突变体相比较时，还呈现更好的效率和更少的偏性。在公开的组合物中用于dA加尾反应的酶是嵌合DNA聚合酶，其没有5'-3'或3'-5'外切核酸酶活性，由栖热菌属DNA聚合酶和非特异性DNA结合结构域间的融合所生成。适于生成在本专利技术中所使用的这样的嵌合DNA聚合酶的DNA结合结构域可能选自由来自Sso家族DNA结合蛋白的DNA结合结构域组成的组，其包括，但不限于，来自超嗜热古细菌(hyperthermophilicarchaebacteria)硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶组合物，其包含在单个容器内的包含三磷酸核苷的缓冲液和能够单独使DNA片段钝化、磷酸化和腺苷酸化的多种酶，其中能够使DNA腺苷酸化的所述酶是嗜热经修饰DNA聚合酶，并且所述组合物在4℃下稳定至少1周。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.25 US 61/882480;2013.11.15 US 61/9045431.一种酶组合物，其包含在单个容器内的包含三磷酸核苷的缓冲液和能够单独使DNA
片段钝化、磷酸化和腺苷酸化的多种酶，其中能够使DNA腺苷酸化的所述酶是嗜热经修饰
DNA聚合酶，并且所述组合物在4℃下稳定至少1周。
2.如权利要求1所述的组合物，其中能够使DNA片段钝化和磷酸化所述酶选自由以下组
成的组：T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核苷酸激酶。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述嗜热经修饰DNA聚合酶基本上缺乏5'-3'和3'-
5'外切核酸酶活性。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述嗜热经修饰DNA聚合酶是被融合到非特异性
DNA结合结构域的栖热菌属嗜热DNA聚合酶。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述嗜热经修饰DNA聚合酶来自栖热菌属，被融合
到来自Sso家族的非特异性DNA结合结构域。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述三磷酸核苷是dATP、dCTP、dTTP和dGTP，其中
dATP的浓度范围是0.4至3mM，dCTP的浓度范围是0.2至0.6mM，dTTP的浓度范围是0.2至
0.6mM，且dGTP的浓度范围是0.1至0.4mM。
7.如权利要求1所述的组合物，其中dATP的浓度是约2mM，dCTP的浓度是约0.4mM，dTTP
的浓度是约0.4mM，且dGTP的浓度是约0.2mM。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述缓冲液还包含至少一种选自由以下组成的组
的组分：Tris-HCl、MgCl2、DTT、选自NaCl、KCl和LiCl的单价金属盐酸盐、ATP、TritonX-
100、甘油、NP40、EDTA和吐温20。
9.如权利要求7所述的组合物，其中当存在时，在pH8.0至8.8时，Tris-HCl的浓度范围
是100mM至105mM(包括端值)；MgCl2的浓度范围是15至25mM(包括端值)，DDT的浓度范围是
15至30mM(包括端值)，单价金属盐酸盐的浓度范围是20mM至50mM(包括端值)，ATP的浓度范
围是1.5至2.5mM(包括端值)，TritonX-100的浓度范围是0.1至0.4％(包括端值)；甘油的浓
度范围是10至20％(包括端值)；NP40的浓度范围是0.05至0.15％(包括端值)，EDTA的浓度
范围是0.02至0.1mM(包括端值)，且吐温20的浓度范围是0.05至0.15％(包括端值)。
10.如权利要求2所述的组合物，其中T4DNA聚合酶的浓度范围是0.2至0.5u/μl(包括
端值)，Klenow片段的浓度范围是0.1至0.2u/μl(包括端值)，且T4多核苷酸激酶的浓度范...

【专利技术属性】
技术研发人员：J卢比恩，A贝雷斯尼亚科瓦斯，A卢比斯，
申请(专利权)人：赛默飞世尔科技波罗的海有限公司，
类型：发明
国别省市：立陶宛;LT