包含5′TOP UTR的人工核酸分子制造技术

本发明专利技术涉及一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含至少一个源自TOP基因的5′UTR元件，至少一个可读框和任选地至少一个3′UTR元件，所述3′UTR元件包含优选源自提供稳定mRNA的基因诸如白蛋白基因的3′UTR，或源自提供稳定mRNA的基因的3′UTR的变体的核酸序列。本发明专利技术还涉及此种人工核酸分子在基因治疗和/或基因接种疫苗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含5′TOPUTR的人工核酸分子本专利技术涉及人工核酸分子，所述人工核酸分子包含源自TOP基因的5′UTR的5′UTR元件，可读框，和任选地3′UTR元件，多聚腺苷酸序列和/或多腺苷酸化信号。本专利技术还涉及包含源自TOP基因的5′UTR的5′UTR元件的载体，包含所述人工核酸分子或所述载体的药物组合物，和包含所述人工核酸分子、所述载体和/或所述药物组合物的试剂盒，优选用于基因治疗和/或基因疫苗接种领域的用途。基因治疗和基因接种疫苗属于最有希望和快速发展的现代医学方法。它们可以为种种疾病的治疗提供高度特异和个性化选择。尤其是，不仅遗传病，而且自身免疫疾病、癌或肿瘤相关疾病以及炎性疾病可以是此种治疗方法的对象。而且，人们设想通过这些方法预防此类疾病的(早期)发病。基因治疗背后的主要构思理念为适当调节与特定疾病的病理状态相关的受损的基因表达。病理学上改变的基因表达可以导致缺少或过量生产关键基因产物，例如，信号传导因子诸如激素，看家因子(housekeepingfactors)，代谢酶，结构蛋白等。改变的基因表达可以不仅由于转录和/或翻译的错误调节，而且还由于编码特定蛋白的ORF内的突变。病理突变可以由例如染色体畸变，或由更特异突变，如点或移码突变引起，它们全部都导致受限的功能和，可能完全丧失基因产物的功能。然而，转录或翻译的错误调节也可以发生，如果突变影响编码参与细胞的转录或翻译机制的蛋白的基因。此种突变可以导致基因病理上调或下调，其因此是功能性的。编码发挥此种调节功能的基因产物的基因，可以是例如，转录因子、信号受体、信使蛋白等。然而，此种编码调节蛋白的基因的功能缺失，在某些情况下可以由人工引入进一步作用于受损的基因产物下游的其它因子反转。此种基因缺陷还可以通过置换受影响基因本身的基因治疗补偿。基因接种疫苗允许引起对选择的抗原所需的免疫应答，所述选择的抗原诸如细菌表面的特征组分、病毒粒子、肿瘤抗原等。一般而言，疫苗接种是现代医学的关键性成就之一。然而，目前仅对较小量的疾病有可用的有效疫苗。因此，不能由疫苗接种预防的感染每年仍然影响数百万人。通常，疫苗可以细分为“第一代”，“第二代”和“第三代”疫苗。“第一代”疫苗典型地是，全生物体疫苗。它们基于活的和减毒或被杀灭的病原体，例如病毒，细菌等。活疫苗和减毒疫苗的主要缺点是向危及生命的变体回复的风险。因此，尽管被减毒，但此种病原体本质上仍然可以带有不可预测的风险。杀灭的病原体可能不如所需要的那样有效产生特异免疫应答。为了最小化这些风险，开发了“第二代”疫苗。这些典型地为亚单位疫苗，所述亚单位疫苗由源自病原体的限定的抗原或重组蛋白组分组成。基因疫苗，即用于基因接种的疫苗，通常被理解为“第三代”疫苗。它们典型地由遗传改造的核酸分子构成，所述遗传改造的核酸分子允许表达对于体内病原体或肿瘤抗原为特征性的肽或蛋白(抗原)片段。在施用于患者并由感受态细胞摄取后，基因疫苗表达。施用的核酸的表达导致产生编码的蛋白。如果这些蛋白被患者的免疫系统识别为外源，则引发免疫应答。如从上文可以看出的，基因治疗和基因接种疫苗方法，基本上都基于向患者施用核酸分子并随后转录和/或翻译编码的遗传信息。备选地，基因接种疫苗或基因治疗还可以包含以下方法，所述方法包括从要治疗的患者分离特异体细胞，随后体外转染此种细胞，并将处理后的细胞再施用于患者。DNA以及RNA可以用作在基因治疗或基因接种疫苗范畴内施用的核酸分子。已知DNA相对稳定并易于操作。然而，使用DNA承担施用的DNA-片段不希望的插入患者基因组中、从而导致受损基因功能的丧失的风险。作为进一步的风险，出现不希望产生的抗DNA抗体。另一个缺点是在DNA施用和其转录/翻译后可以获得的编码肽或蛋白的有限表达水平。在其它原因中，施用的DNA的表达水平将依赖于调节DNA转录的特定转录因子的存在。缺少此种因子的情况下，DNA转录将不产生令人满意量的RNA。从而，获得的翻译的肽或蛋白的水平有限。通过使用RNA替代DNA用于基因治疗或基因接种疫苗，不希望的基因组整合和抗DNA抗体产生的风险被最小化或被避免。然而，RNA被认为是相当不稳定的分子种类，其可以容易地被遍在的RNA酶降解。体内，RNA-降解促进调节RNA半衰期。该效果被认为和证明是精细调整真核基因表达的调节(Friedel等人，ConservedprinciplesofmammaliantranscriptionalregulationrevealedbyRNAhalf-life，NucleicAcidResearch，2009，1-12)。因此，每个天然存在的mRNA具有依赖于mRNA源自的基因的其各自的半衰期。其促进调节该基因的表达水平。不稳定RNA对于及时在不同点实现瞬时基因表达是重要的。然而，耐久的RNA可能与不同蛋白的积累或基因的连续表达相关。在体内，mRNA的半衰期还可以依赖于环境因素，如激素处理，如例如对胰岛素样生长因子I，肌动蛋白，和白蛋白mRNA所显示的(Johnson等人，NewlysynthesizedRNA：SimultaneousmeasurementinintactcellsoftranscriptionratesandRNAstabilityofinsulin-likegrowthfactorI，actin，andalbuminingrowthhormone-stimulatedhepatocytes，Proc.Natl.Acad.Sci.，第88卷，第5287-5291页，1991)。对于基因治疗和基因接种疫苗，通常需要稳定的RNA。一方面，这是由于由RNA-序列编码的产物在体内积累的事实。另一方面，当在其储存过程中制备合适剂型时，和当施用时，RNA必须保持其结构和功能完整性。因此，对提供用于基因治疗或基因接种疫苗的稳定RNA分子投入相当大的关注，以阻止它们经历早期降解或衰变。据报道，核酸分子的G/C-含量可以影响其稳定性。因此，包含增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的核酸可以比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的核酸在功能上更稳定。在这方面，WO02/098443提供含有由翻译区中的序列修饰稳定化的mRNA的药物组合物。此序列修饰利用遗传密码简并性。因此，含有不太有利的核苷酸组合(就RNA稳定性而言不太有利)的密码子可以在不改变编码的氨基酸序列的情况下被替代的密码子置换。该RNA稳定化方法受提供不允许留下所需氨基酸序列间隔的各个单个RNA分子的特定核苷酸序列限制。此外，该方法受限于RNA编码区。作为mRNA稳定化的备选方案，已经发现天然存在的真核mRNA分子含有特征稳定化元件。例如，它们可以包含在其5′末端(5′UTR)和/或在其3′末端(3′UTR)的所谓非翻译区(UTR)以及其它结构特征，如5′帽结构或3′-多聚腺苷酸尾。5′UTR和3′UTR二者都典型地从基因组DNA转录并且因此是成熟前(premature)mRNA元件。在mRNA加工过程中，成熟mRNA的特有结构特征，如5′帽和3′-多聚腺苷酸尾(也称为多聚腺苷酸尾或多聚腺苷酸序列)通常被添加于转录的(成熟前)mRNA。3′-多聚腺苷酸尾典型地是添加在转录的mRNA的3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含：a.至少一个5′‑非翻译区元件(5′UTR元件)，所述5′‑非翻译区元件包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成，所述核酸序列源自TOP基因的5′UTR或源自TOP基因的5′UTR的变体；和b.至少一个可读框(ORF)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.27 EP PCT/EP2012/001334;2012.06.08 EP PCT/1.一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含：a.至少一个5′-非翻译区元件(5′UTR元件)，所述5′-非翻译区元件由以下核酸序列组成，所述核酸序列是哺乳动物TOP基因的5′UTR，其中所述5′UTR元件不含有功能性5′末端寡嘧啶束；b.至少一个可读框(ORF)；和c.至少一个3′UTR元件，所述3′UTR元件由以下核酸序列组成，所述核酸序列是哺乳动物白蛋白基因的3′UTR。2.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3′UTR元件由以下核酸序列组成，所述核酸序列是人白蛋白基因的3′UTR。3.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3′UTR元件由以下核酸序列组成，所述核酸序列是根据GenBank登录号NM_000477.5的人白蛋白基因的3′UTR。4.根据权利要求1或2所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3′UTR元件呈现至少50个核苷酸的长度。5.根据权利要求1或2所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3′UTR元件呈现至少75个核苷酸的长度。6.根据权利要求1或2所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3′UTR元件呈现至少100个核苷酸的长度。7.根据权利要求1或2所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3′UTR元件呈现至少125个核苷酸的长度。8.根据权利要求1或2所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3′UTR元件呈现至少150个核苷酸的长度。9.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述5′UTR元件和所述可读框是异源的。10.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述5′UTR元件适于增加来自所述人工核酸分子的蛋白生产。11.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中5′UTR元件在其5′末端以位于TOP基因的5′UTR的5′末端寡嘧啶束下游的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9或10处的核苷酸起始。12.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中5′UTR元件在其3′末端以位于其所源自的基因或mRNA的可读框的起始密码子的上游的位置1，2，3，4，5，6，7，8，9或10的核苷酸终止。13.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中TOP基因的5′UTR的所述核酸序列是人TOP基因的5′UTR。14.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述至少一个3′UTR元件和所述至少一个5′UTR元件协同地作用来增加来自所述人工核酸分子的蛋白生产。15.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其还包含d.多聚腺苷酸序列和/或多腺苷酸化信号。16.根据权利要求15所述的人工核酸分子，其中所述多腺苷酸化信号位于3′UTR元件内。17.根据权利要求15或16所述的人工核酸分子，其中所述多腺苷酸化信号包含共有序列NN(U/T)ANA，其中N＝A或U。18.根据权利要求15或16所述的人工核酸分子，其中所述多腺苷酸化信号包含共有序列AA(U/T)AAA或A(U/T)(U/T)AAA。19.根据权利要求17所述的人工核酸分子，其中在所述多腺苷酸化信号中，所述共有序列NNUANA位于3′UTR的3′末端上游少于50个核苷酸处。20.根据权利要求15所述的人工核酸分子，其中所述多聚腺苷酸序列具有20至300个腺嘌呤核苷酸的长度。21.根据权利要求15所述的人工核酸分子，其中所述多聚腺苷酸序列具有40至200个腺嘌呤核苷酸的长度。22.根据权利要求15所述的人工核酸分子，其中所述多聚腺苷酸序列具有50至100个腺嘌呤核苷酸的长度。23.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述5′UTR元件是编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5′UTR。24.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述5′UTR元件由以下组成：根据SEQIDNOs.67，259，1284-1318，1344，1346，1348-1354，1357，1358，1421或1422中任一项的核酸序列或根据相应RNA序列的核酸序列。25.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述5′UTR元件由以下组成：哺乳动物核糖体大蛋白32基因(RPL32)，核糖体大蛋白35基因(RPL35)，核糖体大蛋白21基因(RPL21)，哺乳动物ATP合酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚基1、心肌(ATP5A1)基因，哺乳动物羟类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)，哺乳动物雄激素诱导的1基因(AIG1)，哺乳动物细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)，或哺乳动物N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)的核酸序列。26.根据权利要求25所述的人工核酸分子，其中所述5′UTR元件由以下组成：人核糖体大蛋白32基因(RPL32)，人核糖体大蛋白35基因(RPL35)，人核糖体大蛋白21基因(RPL21)，人ATP合酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚基1、心肌(ATP5A1)基因，人羟类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)，人雄激素诱导的1基因(AIG1)，人细胞色素c氧化酶亚基VIc基因(COX6C)，或人N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)的核酸序列。27.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述5′UTR元件由以下组成：根据SEQIDNO.1368或SEQIDNOs1412-1420的核酸序列，或根据相应RNA序列的核酸序列。28.根据权利要求1所述的人工核酸分子，其中所述至少一个5′UTR元件是功能性5′UTR元件并且呈现至少20个核苷酸。29.根据权利要求28所述的人工核酸分子，其中所述至少一个5′UTR元件呈现至少30个核苷酸的长度。30.根据权利要求28所述的人工核酸分子，其中所述至少一个5’UTR元件呈现至少40个核苷酸的长度。31.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈亚斯·特斯，
申请(专利权)人：库瑞瓦格有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE